Las técnicas de amplificación de señal son de gran utilidad cuando la intensidad de fluorescencia obtenida por métodos convencionales no es suficiente para detectar con fiabilidad la molécula o estructura de interés. Son especialmente útiles cuando la concentración del elemento está próxima al límite de sensibilidad del sistema óptico o cuando se desea mejorar la relación señal/ruido en muestras complejas (pérdida de señal por fijación o lavado, estudio de moléculas poco accesibles o anticuerpos con baja afinidad entre otros).
Independientemente del fundamento o principio utilizado por la técnica, el resultado es un incremento de la sensibilidad y la obtención de imágenes más nítidas y contrastadas gracias a la multiplicación del número de fluoróforos o etiquetas por evento de unión.
La amplificación de señal por tiramida consiste en la deposición catalizada de tiramida por la enzima peroxidasa de rábano (HRP), que convierte la tiramida en una forma reactiva capaz de unirse covalentemente a proteínas cercanas, concentrando el marcador en la molécula diana.
La especificidad se logra al conjugar la HRP con un anticuerpo secundario o estreptavidina, produciendo así una intensa amplificación de señal local.
La técnica de amplificación en círculo rodante permite la detección de RNA o ADN in situ con alta sensibilidad y resolución espacial. Se utiliza un oligonucleótido lineal diseñado específicamente para la secuencia diana, con extremos que se aparean con esta secuencia por ligadura dando lugar a ADN circular. Por acción de un primer y una DNA polimerasa con desplazamiento de cadena, se sintetiza una larga hebra lineal repetitiva. A esta hebra se unen muchas sondas fluorescentes logrando la amplificación de la señal. Al ser la RCA una técnica de amplificación en isotermia, no requiere de termociclador y es especialmente útil en aplicaciones de detección in situ.
La PCR in situ permite la detección de secuencias específicas de ADN o RNA directamente dentro de células fijadas, ya sea cortes histológicos o células adheridas a portaobjetos. Permite visualizar y localizar secuencias nucleicas dentro de la morfología celular o tisular. Se basa en la incubación, tras la permeabilización y fijación adecuada, con reactivos que permitan la amplificación de secuencias por PCR.
Existen distintos tipos de PCR in situ: directa (el producto amplificado incorpora directamente moléculas marcadas), indirecta (permite una mayor especificidad al hibridar con sondas marcadas el producto de amplificación) o RT-PCR in situ (combina la retrotranscripción con la hibridación in situ).
El uso de conjugados fluorescentes de estreptavidina permite la detección de biomoléculas biotiniladas, como anticuerpos primarios y secundarios, ligandos, toxinas o sondas de ADN, en aplicaciones como hibridación in situ o microscopía de fluorescencia. La señal puede amplificarse porque cada molécula biotinilada puede llevar varias biotinas, y a cada biotina puede unirse un complejo estreptavidina-fluoróforo, aumentando así la intensidad de la señal.
