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UNIDAD DE MICROSCOPÍA IPBLN GRANADA


TÉCNICAS DE PROXIMIDAD E INTERACCIÓN MOLECULAR

Estas técnicas denominadas de proximidad óptica permiten estudiar interacciones moleculares dentro de la célula con una resolución que va más allá de la simple coincidencia espacial, aportando una comprensión más profunda de los procesos celulares. Cada técnica utiliza principios físicos diferentes: transferencia de energía, reconstitución de fluoróforos o correlación de señales. De este modo, estas metodologías hacen posible detectar cuando dos proteínas, ácidos nucleicos o complejos se encuentran a distancia mínima, normalmente inferior a 10 nanómetros.

A continuación, se incluyen varias técnicas experimentales que pueden emplearse en microscopía:


Proximity Ligation Assay (PLA)

La técnica PLA permite la detección in situ de interacciones moleculares con alta sensibilidad y especificidad. Se fundamenta en el uso de pares de anticuerpos primarios de especies diferentes marcados con oligonucleótidos complementarios. Cuando los objetivos moleculares se encuentran en proximidad espacial igual o inferior a 10nm, los oligonucleótidos se aparean y sirven de plantilla de amplificación ofreciendo información por debajo del límite de resolución óptica. Se utiliza para el estudio de interacciones proteína-proteína, modificaciones postraduccionales y proximidad entre proteínas y ácidos nucleicos.

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

La técnica FRET permite el estudiar la proximidad entre dos moléculas marcadas con fluoróforos distintos. Se basa en la transferencia de energía desde un fluoróforo (dador) a otro (aceptor) cuando ambas moléculas se encuentran a distancia igual o inferior a 10nm. Permite analizar interacciones proteína–proteína, procesos de escisión enzimática y cambios conformacionales.

Enlace de FRET en Leica


Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

La técnica BiFC permite detectar interacciones entre proteínas en células vivas mediante la unión de cada proteína de interés a un fragmento de una proteína fluorescente dividida. Cuando las proteínas se encuentran a distancia cercana (1–10 nm) los fragmentos se ensamblan y la proteína fluorescente recupera su estructura y emite señal. La intensidad y distribución de la señal informan de: fuerza/abundancia de la interacción, y localización celular donde se produce la interacción.