Secuenciación de DNA
La secuenciación de DNA se realiza mediante el procedimiento de secuenciación cíclica utilizando la química BigDyeTerminator v3.1 y electroforesis en sistema multicapilar automático. El material genético de partida incluye DNA plasmídico, productos de PCR, DNA de cadena simple, BAC, cósmido o DNA genómico bacteriano.
Solicitud
En el caso en el que el investigador a imputar el cargo del servicio sea un nuevo usuario deberá cumplimentar y adjuntar con la primera solicitud el formulario de Datos de Facturación debidamente firmado.
FORMULARIO DE DATOS DE FACTURACIÓN
| datos_de_facturacion.doc |
Con cada nueva entrega las muestras deberán ir acompañadas del impreso de solicitud debidamente cumplimentado y firmado por el investigador o persona responsable.
FORMULARIO DE SOLICITUD
| solicitud_sec.doc |
Preparación y entrega de muestras
1. La muestra deberá ir en un tubo de 0,5 ml . El nombre irá rotulado en la tapa y en el lateral del tubo. Cuando el número de muestras sea elevado, podrán entregarse, si el usuario así lo prefiere, dispensadas en placas de 96 pocillos, siempre en formato de columnas. En este caso se acompañará una plantilla indicando la disposición de las muestras en la placa.
2. El volumen total de la muestra deberá estar ajustado a12 µl.
3. Los tubos conteniendo las muestras deberán ser centrifugados (con un pulso es suficiente) antes de depositarlos en una gradilla habilitada en el congelador (–20 ºC) del laboratorio de secuenciación, de forma que las muestras queden en el fondo de los tubos. Todas las muestras deberán ir acompañadas de su correspondiente solicitud de secuenciación debidamente cumplimentada que será depositada en la bandeja correspondiente anexa al congelador.
4. Para las muestras enviadas por correo o mensajería, se recomienda el uso de “sobres acolchados” o similar, para proteger los tubos de posibles roturas durante el envío.
5. La muestra contendrá el molde (DNA) y el oligo (primer), en las cantidades que se recomiendan en la siguiente tabla, dependiendo del tipo de DNA.
- IMPORTANTE: En la asignación del nombre, utilizar solo: números , letras latinas, y los siguientes signos: - ( ) # . + . No usar espacios en blanco, ni ñ, ni letras griegas, ni otros signos distintos a los mencionados anteriormente (como ´ ó /), y como máximo utilizar 12 caracteres.
2. El volumen total de la muestra deberá estar ajustado a12 µl.
- IMPORTANTE: Utilizar solo agua desionizada (calidad MilliQ o similar), tanto para el ajuste de volumen como para la resuspensión del DNA y el oligo.
3. Los tubos conteniendo las muestras deberán ser centrifugados (con un pulso es suficiente) antes de depositarlos en una gradilla habilitada en el congelador (–20 ºC) del laboratorio de secuenciación, de forma que las muestras queden en el fondo de los tubos. Todas las muestras deberán ir acompañadas de su correspondiente solicitud de secuenciación debidamente cumplimentada que será depositada en la bandeja correspondiente anexa al congelador.
4. Para las muestras enviadas por correo o mensajería, se recomienda el uso de “sobres acolchados” o similar, para proteger los tubos de posibles roturas durante el envío.
5. La muestra contendrá el molde (DNA) y el oligo (primer), en las cantidades que se recomiendan en la siguiente tabla, dependiendo del tipo de DNA.
| TIPO DE MOLDE | TAMAÑO | CANTIDAD DE DNA | CANTIDAD DE OLIGONUCLEOTIDO |
| PRODUCTO DE PCR | 100-200 bp | 2-6 ng | 6.4 pmol |
| 200-500 bp | 6-20 ng | 6.4 pmol | |
| 500-1000 bp | 10-40 ng | 6.4 pmol | |
| 1000-2000 bp | 20-80 ng | 6.4 pmol | |
| 2000 bp | 80-200 ng | 6.4 pmol | |
| DNA cadena sencilla | - | 100-200 ng | 6.4 pmol |
| DNA plasmídico | - | 400-800 ng | 6.4 pmol |
| BAC, CÓSMIDO* | - | 1000-2000 ng | 10-20 pmol |
| DNA genómico bacteriano* | - | 4000-6000 ng | 12-26 pmol |
*En estos casos los protocolos de secuenciación varían por lo que es necesario indicarlo claramente en la hoja de solicitud
Envio de resultados
Por norma general, los resultados de secuenciación serán enviados a los 3-5 días contabilizados de lunes a viernes no festivos desde el momento de la entrada de las muestras al Servicio.
Los resultados de las secuenciaciones están contenidos en ficheros con extensión ".ab1". Los resultados se envian como archivos adjuntos por email a la dirección de correo electrónico especificada por el usuario en la hoja de solicitud. Cuando el número de secuencias sea superior a 12, los resultados se enviarán comprimidos en formato ".zip".
Los ficheros se generan con la siguiente denominación:
(posición de la muestra en la placa)_(nombre de la muestra).ab1
Ejemplo: A01_nombre muestra.ab1
Existen diferentes softwares tanto libres como de pago para abrir los ficheros .ab1. A continuación se proporcionan los enlaces para la descarga de dos de estos softwares:
Seleccionar "Sequence scanner software" en el menu desplegable y a continuación registrarse en la pagina para acceder al software.
Los resultados de las secuenciaciones están contenidos en ficheros con extensión ".ab1". Los resultados se envian como archivos adjuntos por email a la dirección de correo electrónico especificada por el usuario en la hoja de solicitud. Cuando el número de secuencias sea superior a 12, los resultados se enviarán comprimidos en formato ".zip".
Los ficheros se generan con la siguiente denominación:
(posición de la muestra en la placa)_(nombre de la muestra).ab1
Ejemplo: A01_nombre muestra.ab1
Existen diferentes softwares tanto libres como de pago para abrir los ficheros .ab1. A continuación se proporcionan los enlaces para la descarga de dos de estos softwares:
- Para PC: programa Sequence scanner v1.0.
Seleccionar "Sequence scanner software" en el menu desplegable y a continuación registrarse en la pagina para acceder al software.
- Para Mac: programa 4 peaks.
Problemas frecuentes y soluciones
La calidad de los resultados obtenidos depende en gran medida de la pureza y correcta cuantificación de las muestras de DNA analizadas. Se recomienda utilizar protocolos de extracción, purificación y cuantificación fiables que permitan verificar la integridad y concentración de la muestra. Asimismo, se recomienda la utilización de alicuotas fiables del primer de secuenciación. Es muy importante que el usuario prepare LAS MUESTRAS SIEMPRE DILUIDAS EN AGUA. Evitar el tampón TE y los buffers de elución del ADN de los kits comerciales porque la presencia de EDTA en la muestra inhibe la reacción de secuenciación.
Problemas más comunes:(consultar guía de secuenciación)
Problemas más comunes:(consultar guía de secuenciación)
- No se produce reacción o esta decae poco después de comenzar.
- Señal de baja intensidad.
- El cromatograma es correcto pero presenta mucho ruido de fondo.
- El cromatograma presenta una secuencia sombra.
- El cromatograma presenta dos secuencias superpuestas.
- La reacción empieza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado punto.
- La secuencia pierde bruscamente la señal y cae.
- La señal decae progresivamente de forma temprana.
- Doble lectura inicial que se resuelve antes de la base 200.
- Presencia de picos saturados y fuera de escala en el cromatograma.
- Presencia de picos anómalos para uno o varios fluoróforos alrededor de las posiciones 70 y 160.
- Presencia de un pico intenso anómalo correspondiente a los cuatro fluoróforos.
- Picos muy abiertos y de baja resolución.
- Regiones ricas en GC.
- Pérdida de señal tras una región rica en Gs.
- Presencia de microsatélites.
Se recomienda a los usuarios nuevos que consulten esta guía antes de enviar por primera vez sus muestras, así como a todos aquellos usuarios que hayan obtenido resultados no satisfactorios o inesperados.