UNIDAD DE GENÓMICA

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Secuenciación de DNA


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La secuenciación de DNA se realiza mediante el procedimiento de secuenciación cíclica utilizando la química BigDyeTerminator v3.1 y electroforesis en sistema multicapilar automático. El material genético de partida incluye DNA plasmídico, productos de PCR, DNA de cadena simple, BAC, cósmido o DNA genómico bacteriano.

  • Solicitud
  • Preparación y entrega de muestras
  • Envio de resultados
  • Problemas frecuentes y soluciones


Solicitud

En el caso en el que el investigador a imputar el cargo del servicio sea un nuevo usuario deberá cumplimentar y adjuntar con la primera solicitud el formulario de Datos de Facturación debidamente firmado.

 

FORMULARIO DE DATOS DE FACTURACIÓN

datos_de_facturacion.doc
File Size: 38 kb
File Type: doc
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Con cada nueva entrega las muestras deberán ir acompañadas del impreso de solicitud debidamente cumplimentado y firmado por el investigador o persona responsable.

 

FORMULARIO DE SOLICITUD

solicitud_sec.doc
File Size: 64 kb
File Type: doc
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Preparación y entrega de muestras

1. La muestra deberá ir en un tubo de 0,5 ml . El nombre irá rotulado en la tapa y en el lateral del tubo. Cuando el número de muestras sea elevado, podrán entregarse, si el usuario así lo prefiere, dispensadas en placas de 96 pocillos, siempre en formato de columnas. En este caso se acompañará una plantilla indicando la disposición de las muestras en la placa.
  • IMPORTANTE: En la asignación del nombre, utilizar solo: números , letras latinas, y los siguientes signos:   -  ( ) # . + . No usar espacios en blanco, ni ñ, ni letras griegas,  ni otros signos distintos a los mencionados anteriormente (como ´ ó  /),  y como máximo utilizar 12  caracteres.

2. El volumen total de la muestra deberá estar ajustado a 12 µl.
  • IMPORTANTE: Utilizar solo agua desionizada (calidad MilliQ o similar), tanto para el ajuste de volumen como para la resuspensión del DNA y el oligo.

3. Los tubos conteniendo las muestras deberán ser centrifugados (con un pulso es suficiente) antes de depositarlos en una gradilla habilitada en el congelador (–20 ºC)  del laboratorio de secuenciación, de forma que las muestras queden en el fondo de los tubos. Todas las muestras deberán ir acompañadas de su correspondiente solicitud de secuenciación debidamente cumplimentada que será depositada en la bandeja correspondiente anexa al congelador.

4. Para las muestras enviadas por correo o mensajería, se recomienda el uso de “sobres acolchados” o similar, para proteger los tubos de posibles roturas durante el envío.

5. La muestra contendrá el molde (DNA) y el oligo (primer), en las cantidades que se recomiendan en la siguiente tabla, dependiendo del tipo de DNA.
TIPO DE MOLDE TAMAÑO CANTIDAD DE DNA CANTIDAD DE OLIGONUCLEOTIDO
PRODUCTO DE PCR 100-200 bp 2-6 ng 6.4 pmol
200-500 bp 6-20 ng 6.4 pmol
500-1000 bp 10-40 ng 6.4 pmol
1000-2000 bp 20-80 ng 6.4 pmol
2000 bp 80-200 ng 6.4 pmol
DNA plasmídico < 5000 bp  600-800 ng 6.4 pmol
DNA plasmídico > 5000 bp 1000-2000 ng 10-20 pmol

En caso de ser necesaria la adaptación del protocolo de secuenciación indicarlo claramente en la hoja de solicitud


Envio de resultados

Por norma general, los resultados de secuenciación serán enviados a los 3-5 días contabilizados de lunes a viernes no festivos desde el momento de la entrada de las muestras al Servicio.

Los resultados de las secuenciaciones están contenidos en ficheros con extensión ".ab1". Los resultados se envian como archivos adjuntos por email a la dirección de correo electrónico especificada por el usuario en la hoja de solicitud. Cuando el número de secuencias sea superior a 12, los resultados se enviarán comprimidos en formato ".zip".

Los ficheros se generan con la siguiente denominación:
(posición de la muestra en la placa)_(nombre de la muestra).ab1
Ejemplo: A01_nombre muestra.ab1

Existen diferentes softwares tanto libres como de pago para abrir los ficheros .ab1. A continuación se proporcionan los enlaces para la descarga de dos de estos softwares:

  • Para PC: programa Sequence scanner v1.0.
Descarga en la dirección http://www.appliedbiosystems.com/support/software/
Seleccionar
"Sequence scanner software" en el menu desplegable  y a continuación registrarse en la pagina para acceder al software.
  • Para Mac: programa 4 peaks.
Descarga en la dirección: http://mekentosj.com/science/4peaks/

Problemas frecuentes y soluciones

La calidad de los resultados obtenidos depende en gran medida de la pureza y correcta cuantificación de las muestras de DNA analizadas. Se recomienda utilizar protocolos de extracción, purificación y cuantificación fiables que permitan verificar la integridad y concentración de la muestra. Asimismo, se recomienda la utilización de alicuotas fiables del primer de secuenciación. Es muy importante que el usuario prepare  LAS MUESTRAS SIEMPRE DILUIDAS EN AGUA. Evitar el tampón TE y los buffers de elución del ADN de los kits comerciales porque la presencia de EDTA en la muestra inhibe la reacción de secuenciación.

Problemas más comunes:(consultar guía de secuenciación)

  1. No se produce reacción o esta decae poco después de comenzar.
  2. Señal de baja intensidad.
  3. El cromatograma es correcto pero presenta mucho ruido de fondo.
  4. El cromatograma presenta una secuencia sombra.
  5. El cromatograma presenta dos secuencias superpuestas.
  6. La reacción empieza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado punto.
  7. La secuencia pierde bruscamente la señal y cae.
  8. La señal decae progresivamente de forma temprana.
  9. Doble lectura inicial que se resuelve antes de la base 200.
  10. Presencia de picos saturados y fuera de escala en el cromatograma.
  11. Presencia de picos anómalos para uno o varios fluoróforos alrededor de las posiciones 70 y 160.
  12. Presencia de un pico intenso anómalo correspondiente a los cuatro fluoróforos.
  13. Picos muy abiertos y de baja resolución.
  14. Regiones ricas en GC.
  15. Pérdida de señal tras una región rica en Gs.
  16. Presencia de microsatélites.
En la siguiente guía se pueden encontrar ejemplos gráficos de estos problemas, así como las posibles causas y soluciones.

problemas-secuenciacion.doc
File Size: 607 kb
File Type: doc
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Se recomienda a los usuarios nuevos que consulten esta guía antes de enviar por primera vez sus muestras, así como a todos aquellos usuarios que hayan obtenido resultados no satisfactorios o inesperados.