La captura de proteínas de superficie mediante biotinilación multiplex permite una mejor identificación de las proteínas de la superficie celular mediante espectrometría de masas.

Ana Levi, Tommy Shields, Irbaz I.Badshah, Vinothini Rajeeve, Pedro R. Cutillas.

Relevancia: Este trabajo de investigación fue publicado en la revista Molecular & Cellular Proteomics. Q1

RESUMEN

Objetivos: El estudio parte de la necesidad de mejorar las técnicas de análisis del surfaceoma celular (conjunto de proteínas presentes en la superficie celular). Estas proteínas son fundamentales para la fisiología y la comunicación celular. Es más, constituyen importantes dianas terapéuticas para inmunoterapia, como CAR-T o anticuerpos conjugados a fármacos, también llamados fármacos inmunoconjugados.
Aunque la proteómica basada en espectrometría de masas ha avanzado mucho en el estudio de proteínas de membrana, todavía existen importantes limitaciones. Estas proteínas son muy hidrofóbicas y no se recuperan con tanta fiabilidad como las proteínas intracelulares por lo que están poco representadas en estudios de proteómica convencionales.
Existen métodos de enriquecimiento del surfaceoma como técnicas basadas en la captura de glicoproteínas (CSC), métodos dirigidos a residuos sialilados, o estrategias de biotinilación de grupos amino mediante reactivos NHS-éster. Sin embargo, estos requieren de grandes cantidades de células, no recuperan todas las proteínas de superficie, no tienen gran sensibilidad, y se centran en un único grupo funcional químico de las proteínas.
El estudio plantea desarrollar una nueva estrategia basada en la combinación de distintos reactivos de biotinilación (“multiplex biotinylation”), con el objetivo de aumentar la sensibilidad, reducir la cantidad de muestra necesaria, mejorar la especificidad, y ampliar la cobertura del surfaceoma identificado. Conceptualmente, el método se basa en la premisa de que existen proteínas de superficie que podrían no contener suficientes grupos amino accesibles, por lo que podrían escapar a los métodos tradicionales de biotinilación. Por ello, también se propone el marcaje de grupos carboxilo.

Métodos: 

1. Biotinilación combinada del proteoma de la superficie celular mediante marcaje con grupos reactivos de amina (marcaje con NH2) y carboxilo (marcaje con COOH) 

2. Marcaje de N-glicoproteínas basado en aminooxi-biotina 

3. Aislamiento de proteínas biotiniladas 

4. Preparación de muestras para el Western Blot 

5. Preparación de muestras para proteómica 

6. Espectrometría de masas 

7. Identificación de péptidos a partir de datos de espectrometría de masas en tándem 

8. Cuantificación de péptidos a partir de datos de MS1 

9. Análisis bioinformático 

10. Diseño experimental y fundamentos estadísticos

Resultados: Los resultados demuestran que el método SUCAM mejora significativamente el análisis del surfaceoma celular frente a las estrategias convencionales de biotinilación. Se optimizaron las condiciones experimentales y se comprobó que el método funciona eficazmente incluso con una baja cantidad de muestra (1,2 millones de células), manteniendo buena sensibilidad y reproducibilidad.
La comparación entre distintos reactivos mostró que cada estrategia de biotinilación captura subconjuntos diferentes de proteínas de superficie. En particular, el marcaje de grupos carboxilo aportó mayor especificidad y menor contaminación citoplasmática que algunos métodos amino-reactivos.
Al combinar múltiples reactivos amino y carboxilo en una sola estrategia (“multiplex biotinylation”), SUCAM ha conseguido un mayor enriquecimiento de proteínas de membrana plasmática, menor contaminación intracelular, mayor número total de proteínas de superficie identificadas, y detección de proteínas únicas no recuperadas por otros métodos.
El método mostró buena precisión cuantitativa entre réplicas y permitió identificar tanto marcadores ya conocidos como posibles nuevas dianas terapéuticas en líneas celulares de leucemia mieloide aguda. 

Conclusiones: En este estudio, se ha desarrollado y evaluado la eficacia de una estrategia multiplexada de derivatización con biotina para el enriquecimiento del proteoma de superficie celular, a la que se ha denominado SUCAM. El método consiste en el marcaje simultáneo con dos agentes reactivos con aminas, seguido de un marcaje con carboxilo en una sola reacción. SUCAM aumentó el número de proteínas asociadas a la superficie celular identificadas, las cuales se cuantificaron en unidades absolutas (número de copias) con buena reproducibilidad. Dado que SUCAM permite descubrir una gama más amplia de proteínas de la superficie celular y permite la determinación absoluta del número de copias en superficie a partir de cantidades reducidas de muestra, se espera que este protocolo tenga amplias aplicaciones en estudios de superficieómica, incluido el descubrimiento de nuevos marcadores diagnósticos y posibles dianas terapéuticas para la inmunoterapia.

https://www.mcponline.org/article/S1535-9476(26)00068-X/fulltext

DOI: 10.1016/j.mcpro.2026.101572