Responsable: Puri Fortes
CIMA / UNAV.
Pio XII 55
31008 PAMPLONA.
Teléfono: 948-194700 Ext 4025 Fax: 948-194717
Componentes del grupo:
Puri Fortes, Investigadora, e.mail: pfortes (añada @unav.es)
Xabier Abad Lloret, Postdoctoral, e.mail: xabad (añada @unav.es)
Inés Romero Brey, Postdoctoral, e.mail: iromerobrey (añada @unav.es)
Oscar Aparicio, Becario predoctoral, e.mail: oaparicio (añada @unav.es)
Luciano Sobrevals, Becario predoctoral, e.mail: lsobrevals (añada @unav.es)
Nerea Razquin, Técnico de Laboratorio,e.mail: nrazquin (añada @unav.es)
Líneas de Investigación:
La inhibición específica de la expresión génica se puede utilizar para averiguar la función de genes desconocidos o bloquear la expresión de genes tóxicos para la célula, como genes virales u oncogenes. Ambas posibilidades resultan de enorme interés hoy en día.
1. SILENCIAMIENTO GENICO BASADO EN U1 snRNAs
En el laboratorio hemos desarrollado una técnica de inhibición de la expresión basada en snRNAs U1 modificados. Si expresamos en la célula moléculas de U1 snRNA cuyo extremo 5' se ha modificado para que reconozca secuencias cercanas a zonas de poliadenilación en un mensajero concreto, se inhibe específicamente la poliadenilación de ese mensajero.
El sistema sirve para inhibir la expresión génica tanto de forma transitoria como estable. Hemos estudiado las características de este sistema de inhibición. La distancia entre la zona de interacción de la snRNP U1 y las secuencias de poliadenilación parece irrelevante, de modo que se observa inhibición incluso cuando esta distancia es mayor de 1000 nucleótidos. La eficiencia de la inhibición aumenta cooperativamente cuando a un mismo RNA diana se le unen varias moléculas de la snRNP U1, de modo que con un máximo de tres moléculas se ha conseguido inhibir la expresión hasta 1000 veces. Si las secuencias diana forman estructuras secundarias, se impide la inhibición, probablemente porque el snRNA U1 no puede interaccionar con ellas. Aumentar la longitud del extremo 5´ que interacciona con el RNA diana no mejora la inhibición, probablemente porque los U1s resultantes son poco estables. De hecho la mejor inhibición se obtiene cuando 10 nucleótidos del U1 interaccionan con el RNA diana y para que el sistema funcione hace falta un mínimo de 8 nucleótidos.
FUTURO
Existen posibilidades de mejorar esta técnica inhibitoria. Queremos averiguar y aumentar su especificidad y desarrollar métodos que permitan seleccionar las secuencias diana más accesibles a su efecto. Como ejemplo, estudiaremos las secuencias de los mRNAs del virus de la Hepatitis B (HBV). Los snRNAs U1 modificados que interaccionen eficientemente con estas secuencias, bloquearán la expresión de HBV y por ello, serían candidatos a ser utilizados en protocolos de terapia génica y regeneración de hígados infectados. Se pretende ensayar esta técnica en modelos animales, incluso, utilizando promotores inducibles o específicos de hígado. Por último, queremos aplicar esta tecnología para averiguar función génica utilizando una librería de genes que codifican para snRNAs U1 modificados.
2. SILENCIAMIENTO GENICO BASADO EN RNAi
La interferencia de RNA (RNAi) es un método de inhibir la expresión génica. El mediador de esta inhibición es una molécula pequeña de RNA (siRNA). Nosotros hemos expresado estas moléculas de RNA pequeños a partir de vectores adenovirales y hemos conseguido inhibir la expresión génica en hígado de ratón. En este modelo hemos estudiado el efecto de estos inhibidores en la maquinaria celular de silenciamiento. Además hemos descrito moléculas similares a siRNA en células infectadas por adenovirus.
FUTURO
Queremos utilizar este sistema para estudiar la inhibición por interferencia de RNA “in vivo”. También planeamos estudiar la relación entre la interferencia de RNA y la infección viral en células de mamífero y posibles alteraciones de la interferencia de RNA en distintas enfermedades.
Publicaciones:
- P. Fortes, R. M. Marión, A. Beloso, C. Dotti y J. Ortín. “A human sequence homologue of Staufen is an RNA-binding protein that is associated with polysomes and localizes to the rough endoplasmic reticulum”. Molecular and Cellular Biology, 19, 2212-2219, 1999.
- P. Fortes, J. Kufel, M. Fornerod, M. Polycarpou-Schwarz, D. Lafontaine, D. Tollervey y I. W. Mattaj. “Genetic and physical interactions involving the yeast nuclear cap-binding complex”. Molecular and Cellular Biology, 19, 6543-6553, 1999.
- P. Fortes, D. Bilbao-Cortés, M. Fornerod, G. Rigaut, W. Raymond, B. Séraphin y I. W. Mattaj. “Luc7p, a novel yeast U1 snRNP protein with a role in 5' splice site recognition”. Genes and Development, 13, 2425-2438, 1999.
- P. Fortes, T. Inada, T. Preiss, M. Hentze, I. W. Mattaj y A. Sachs. “The nuclear cap binding complex interacts with the translation initiation machinery and promotes translation in the absence of eIF4E”. Molecular Cell, 6, 191-196, 2000.
- M. G. Kramer, M. A. Barajas, N. Razquin, P. Berraondo, M. Rodrigo, C. Wu, C. Qian, J. Prieto y P. Fortes. “In vitro and in vivo comparative study of chimeric liver specific promoters”. Molecular Therapy, 7, 375-385, 2003.
- P. Fortes, Y. Cuevas, F. Guan, P. Liu, S. Pentlicky, S. Jung, M. L. Martínez-Chantar, J. Prieto, D. Rowe y S. I. Gunderson.. “Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5´end-mutated U1 snRNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA”. PNAS, 100, 8264-8269, 2003.
- M. Vera y P. Fortes. “Simian virus 40 as a gene therapy vector”. DNA and Cell Biology 23, 271-282, 2004
- M. Vera, D. Strayer, J. Prieto y P. Fortes. “Factors influencing the production of recombinant SV40 vectors”. Mol. Therapy, 10, 780-791, 2004.
- H. J. McKee, P. Y. T’sao, M. Vera, P. Fortes y D. S. Strayer. “Durable Cytotoxic Immune Responses Against gp120 Elicited by Recombinant SV40 Vectors Encoding HIV-1 gp120 ± IL-15”. Genetic vaccines and Therapy, 2, 10-21. 2004.
- M. Vera, N. Razquin, J. Prieto, I. Melero, G. Gonzalez-Aseguinolaza y P. Fortes. “Intratumor injection of dendritic cells transduced by a SV40-based vector expressing interleukin-15 induces curative immunity mediated by CD8+ T lymphocytes and NK cells”. Mol Therapy 12, 950-959, 2005
- O. Aparicio, N. Razquin, M. Zaratiegui, I. Naravaiza y P. Fortes. “Adenovirus VA RNA is processed to functional interfering RNAs involved in virus production.” J. Virology 80, 1376-1384. 2006.
- I. Tirapu, E. Huarte, C. Guiducci, A. Arina, M. Zaratiegui, O. Murillo, A. Gonzalez, C. Berasain, P. Berraondo, P. Fortes, J. Prieto, M. P. Colombo, L. Chen y I. Melero. “Low surface expression of B7-1 (CD80) is an immunoescape mechanism of colon carcinoma”. Cancer Res 66, 2442-2450, 2006.
- M. Vera, L. Sobrevals, M. Zaratiegui, L. Martinez, B. Palencia, C. M. Rodríguez, J. Prieto, y P. Fortes. “Liver transduction with a SV40 vector encoding insulin-like growth factor I reduces hepatic damage and the development of liver cirrhosis”. Gene Therapy, en prensa.
- I. Narvaiza, O. Aparicio, M. Vera, N. Razquin, J. Prieto y P. Fortes. “Effect of adenovirus-mediated RNA interference on endogenous micro-RNA functionality in a mouse model of Multidrug Resistance Protein-2 gene silencing.” J. Virology. En revisión.
- P. Fortes, D. Longman, S. McCracken, R. Poot, I. W. Mattaj, J. F. Cáceres y B. J. Blencowe. “Identification and characterization of RED120: a new exon junction complex protein” JBC. En revisión.