Saccharomyces
cerevisiae
Centro Mixto “Instituto de Microbiología Bioquímica”
CSIC/Universidad de Salamanca
Avda. del campo Charro s/n
37007 Salamanca
Teléfono: 923 120673 Fax: 923 224876
Esteban Cañibano, María Rosa, Ciéntifico Titular, mrosa@gugu.usal.es
Tsutomu
Fujimura, Investigador,
Rodríguez Cousiño, María Nieves, Profesora Titular,
Vega Hernández, María Lorena, Becaria Predoctoral,
Líneas de Investigación:
Estamos estudiando los
mecanismos de replicación y mantenimiento de virus con genoma tipo RNA en Saccharomyces cerevisiae. La mayor parte
de las cepas de laboratorio llevan en
su citoplasma RNAs virales; algunos de ellos están encapsidados en partículas
víricas y otros no se encapsidan. El más frecuente dentro del primer grupo es
el virus L-A. El genoma es un RNA bicatenario de 4.6 kb y está encapsidado en
partículas icosaédricas de 40 nm de diámetro. Muchas cepas llevan, además, un
virus satélite de L-A, denominado M1. El genoma de M1 (1.8 kb) codifica para la
producción de la toxina "killer" K1. Nuestro grupo está
trabajando principalmente en el modo de
acción de la RNA polimerasa dependiente de RNA que mantiene estos virus.
Los otros virus objeto de
estudio son dos virus RNA de polaridad positiva pertenecientes a la familia Narnaviridae, denominados "20S
RNA" y "23S RNA". Los genomas son de pequeño tamaño (2.5-3 kb) y
el nombre viene de “Naked RNA
virus” ya que codifican únicamente para una RNA polimerasa dependiente
de RNA y no hay información para proteínas de cápsida. A pesar de no estar
encapsidados, estos RNAs no se encuentran desnudos en el citoplasma de la
levadura, si no que se asocian con sus RNA polimerasas formando complejos
ribonucleoproteicos en los que el RNA y la polimerasa están con una
estequiometría 1:1. A partir de estos complejos parcialmente purificados hemos
puesto a punto un sistema de replicación in vitro para la síntesis de
20S RNA. Con este sistema hemos analizado los intermediarios de la replicación
de este virus y hemos propuesto un modelo de replicación que es similar al de
otros virus RNA de polaridad positiva.
Respecto a 23S RNA, recientemente hemos
puesto a punto un sistema de generación del virus a partir de su cDNA clonado
en un vector de expresión de levaduras.
Este es el primer caso descrito en un virus de levadura. El virus así
generado es estable una vez eliminado el vector y nos permite llevar a cabo
estudios de genética reversa. De esta forma hemos iniciado la caracterización
de las señales en cis existentes en
el extremo 3’ de la cadena (+) importantes en la replicación. En esta zona
hemos determinado la existencia de un señal bipartita formada por una
estructura secundaria en horquilla próxima a dicho extremo, en la cual existen
dos bases no apareada en medio de una zona bicatenaria que son críticas para la
replicación. La otra parte de la señal la constituyen las últimas bases del
extremo 3’. Además hemos detectado la existencia de un sistema de reparación de
dichos extremos in vivo, ya que si se modifican o eliminan las dos
últimas bases en el vector, el virus generado es capaz de repararlas in vivo.
Estamos interesados en estos mecanismos de reparación, ya que estos virus de
levadura infectan de forma persistente la célula y creemos que este mecanismo
puede facilitar el mantenimiento de dichos extremos intactos durante largos
periodos de tiempo.
En resumen, consideramos
los virus RNA de S. cerevisiae como
sistemas modelo para el estudio de los mecanismos de replicación viral y las
interrelaciones virus RNA/hospedador, dada la simplicidad de su organización
genómica y la facilidad de manipulación del hospedador. Los conocimientos
adquiridos se podrán extrapolar a otros virus RNA que infectan células eucarióticas
superiores en las cuales es más difícil abordar un tipo de estudios semejante.
Uno de los aspectos más interesantes es el modo de acción de las RNA
polimerasas dependientes de RNA (enzimas exclusivamente de origen viral).
Además los complejos ribonucleoproteicos en que se encuentran 20S RNA y 23S RNA
constituyen un sistema adecuado para el estudio de las interrelaciones
RNA/proteína. Si se conocen en detalle el modo de replicación de estos virus
así como los procesos metabólicos de la célula que puedan estar afectados por
su presencia será posible diseñar drogas que interfieran específicamente en
algunos de estos procesos, sin dañar al hospedador.
Publicaciones relevantes
(1999-2003):
- SOLORZANO,A.,RODRIGUEZ-COUSIÑO,N.,ESTEBAN,R.,FUJIMURA,T. (2000)
Persistent
yeast single-stranded RNA viruses exist in vivo as genomic RNA.RNA
polymerase complexes in 1.1 stoichiometry J.Biol.Chem. 275:
26428-26435
-
FUJIMURA,T.,ESTEBAN,R. (2000). Recognition of RNA encapsidation signal by the yeast L-A double-stranded
RNA virus J.Biol.Chem. 275: 37118-37126
- ESTEBAN,R., FUJIMURA,T. (2003) Launching the Yeast 23S RNA
Narnavirus Shows 5’ and 3’ cis-acting
Signals for Replication. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100: 2568-2573
- FUJIMURA, T, ESTEBAN, R. Bipartite 3’ cis-acting signal for Replication in
Yeast 23S RNA virus and its Repair. J.Biol.Chem. (enviado).