Replicación y Expresión Génica del Virus de la Gripe
Responsable:
Juan Ortín
Centro Nacional de Biotecnología (CSIC)
Campus de Cantoblanco
Universidad Autónoma de Madrid
28049 Madrid
Teléfono: 91 585 4557 Fax: 91 585 4506
Componentes
del Grupo
Juan Ortín, Profesor
de Investigación
Sandra Ufano, Becaria
Postdoctoral
Eva Torreira, Becaria
predoctoral
Nuria Jorba, Becaria
predoctoral
Estela Area, Becaria
predoctoral
Patricia Villacé, Becaria predoctoral
Urtzi Garaigorta, Becario predoctoral
Alejandro García, Becario predoctoral
Yolanda Fernández, Ayudante técnico
Resultados previos de nuestro grupo habían demostrado la interacción
de la proteína NS1 con la proteína hStaufen. Para entender el papel que esta
interacción juega en la infección, hemos estudiado la función de esta proteína
humana en células en cultivo. Se han purificado complejos intracelulares que
contienen hStaufen mediante dos pasos de cromatografía de afinidad por el
método TAP. Estos complejos contienen un conjunto repetitivo de proteínas cuya
identificación por espectrometría de masas está en proceso (Villacé y cols,
resultados no publicados).
Los RNAs
asociados a estos complejos han sido identificados por clonaje y la
especificidad de su unión se ha verificado mediante el uso de un mutante de
hStaufen defectivo para la unión a RNA in vitro. Entre los RNAs específicos
destacan los de hGoliath y complexina-1, ya que sus genes juegan un papel
importante en el desarrollo y la diferenciación (Marión y cols., resultados no
publicados).
Análisis funcional de la polimerasa viral
Usando como base el alineamiento de secuencias de la subunidad PB2 de
la polimerasa con proteínas que se unen a estructuras cap, se han generado mutantes puntuales en esta subunidad que
alteran posiciones conservadas entre ellas. Una serie de estos mutantes dan
lugar a complejos de polimerasa que están afectadas en su función biológica
pero no en la formación del complejo. El análisis de su funcionalidad en un
sistema de reconstitución in vivo mostró que su capacidad para replicar vRNAs
modelo estaba afectada. Sin embargo, las RNPs mutantes generadas no presentaban
defectos en su capacidad para transcribir in vitro, en un sistema dependiente
de iniciadores con cap. Estos
fenotipos indican que las mutaciones introducidas en PB2 afectan la replicación
pero no la transcripción del genoma viral, en contra de las predicciones
iniciales. Estas conclusiones fueron avaladas al estudiar los fenotipos de
virus mutantes en cuyos genes de PB2 se habían introducido las mutaciones
indicadas. Estos virus mutantes mostraban retraso en su cinética de
replicación, en la síntesis de proteínas virales y en la acumulación de RNAs,
pero su transcripción primaria (independiente de replicación) no estaba
afectada.
Estudios
estructurales de la ribonucleoproteína (RNP) y la polimerasa del virus de la
gripe
Las RNPs virales generadas por reconstitución y
replicación in vivo a partir de cDNAs han sido estudiadas por microscopía
electrónica de muestras teñidas y reconstrucción tridimensional de imágenes. A
partir de una genoteca de RNPs con vRNA moldes de longitud variable se
seleccionó una variante de 248 nucleótidos para su estudio detallado. Su
reconstrucción tridimensional ha permitido revelar una estructura circular en la
que se pueden apreciar 9 monómeros de nucleoproteína (NP) y el complejo de la
polimerasa. El anillo de NP presenta fuertes interacciones entre sus monómeros
en la base de la estructura, sugiriendo que el vRNA puede estar localizado en
dicha zona. Además, los monómeros de NP presentan una vorticidad que puede ser
la causa de la estructura superhelicoidal que presentan las RNPs de mayor
longitud. La polimerasa interacciona de manera desigual con los dos monómeros
de NP adyacentes. Este modelo tridimensional es la primera información
estructural detallada de una RNP de virus con RNA de polaridad negativa.
Estudios más recientes sobre el complejo de la polimerasa de estas RNPs ha
permitido incrementar su resolución e identificar las regiones en las que se
localizan sus subunidades.
Proyectos
en vigor:
Estructura de la
ribonucleoproteína del virus de la gripe: Estudio de los mecanismos de
transcripción y replicación y de los factores celulares implicados. DGICYT. 2002-2004
La proteína NS1
del virus de la gripe: Estudio de sus funciones durante la replicación viral y
uso del gen NS1 como diana para generar virus vacunales atenuados. Comunidad de
Madrid. 2002-2004
Publicaciones
relevantes (1999-2003):
- Marión, R.M.,
Fortes, P., Beloso, A., Dotti, C. and Ortín,
J. 1999. A human sequence homologue of staufen is an RNA-binding protein
that localizes to the polysomes of the rough endoplasmic reticulum Mol. Cell.
Biol. 19, 2212-2219.
- Portela, A.,
Zürcher, T., Nieto, A. and Ortín, J.
1999. Replication of rthomyxoviruses. Advances in Virus Res., 54, 319-348.
- González, S. and
Ortín, J. 1999. Characterization
of the influenza virus PB1 protein binding to vRNA: Two separate regions of the
protein contribute to the interaction domain. J. Virol., 73, 631-637.
- Kiebler, M.A.,
Hemraj, I., Verkade, P., Köhrmann, M., Fortes, P., Marión, R.M., Ortín, J. and Dotti, C. 1999. The
mammalian Staufen protein localizes to the somatodendritic domain of cultured
hippocampal neurons: implications for its involvement in mRNA transport. J. Neurosciences, 19, 288-297.
- Mena, I.,
Jambrina, E., Albó, C., Perales, B., Ortín,
J., Arrese, M., Vallejo, D. and Portela, P. 1999. Mutational analysis
of influenza A virus nucleoprotein: identification of mutations that affect RNA
replication. J. Virol., 73, 1186-1194.
- Falcón, A.M.,
Fortes, P., Marión, R.M., Beloso, A. and Ortín,
J. 1999. Interaction of influenza virus NS1 protein and the human homologue
of Staufen in vivo and in vitro.
Nucleic Acids Res. 27, 2241-2247.
- González, S. and
Ortín, J. 1999. Distinct
regions of influenza virus PB1 polymerase subunit recognize vRNA and cRNA templates. EMBO J. 18,
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- Ortega, J.,
Martín-Benito, J., Zürcher, T., Valpuesta, J.M., Carrascosa, J.L. and Ortín, J. 2000. Ultrastructural
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amplification of RNPs. J. Virol, 74, 156-163.
- Perales, B.,
Sanz-Ezquerro, J.J, Gastaminza, P., Ortega, J., Fernández-Santarén, J., Ortín, J. and Nieto, A. 2000. The
replication activity of influenza virus polymerase is linked to the capacity of
the PA subunit to induce proteolysis. J. Virol. 74,
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la Luna, S., Novoa, I., Carrasco, L., Ortín,
J. and Nieto, A. 2000. Translation factor eIF4GI is a cellular target
for NS1 protein, a translational activator of influenza virus. Mol. Cell. Biol.
20, 6259-6268.
- Zürcher, T.,
Marión, R.M. and Ortín, J. 2000. The protein synthesis shut-off induced by
influenza virus infection is independent
of PKR activity. J. of Virol. 74, 8781-8784.
- Martín-Benito,
J., Area, E., Ortega, J., Llorca, O., Valpuesta, J.M., Carrascosa J.L.and Ortín, J. 2001. Three dimensional
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with homology to a family of transcriptional activators. J. Virol, 75,
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- Gschoesser, C., Almanzar, G.,
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D., Schild, H., Saurwein-Teissl, M., Grubeck-Loebenstein, B. 2002. CD4(+) and CD8(+) mediated cellular
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- Gastaminza,
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- Ortin J. 2003. Unraveling the replication
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influenza virus PA polymerase subunit modulates RNA replication in infectious
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- Area, E.,
Martín-Benito, J., Gastaminza, P., Torreira, E., Valpuesta, J.M., Carrascosa,
J.L. and Ortín, J. 2004. Three dimensional
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domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 308-313.