INICIACIÓN INTERNA DE LA TRADUCCIÓN DIRIGIDA POR ELEMENTOS IRES
Responsable de Grupo:
Encarnación Martínez Salas
Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa CSIC-UAM
C/ Nicolás Cabrera, 1
Campus de Cantoblanco Universidad Autónoma de Madrid Cantoblanco, 28049 Madrid
Teléfono: 911964619
Fax: 911964420
Componentes del grupo:
Encarnación Martínez Salas, Investigador Científico, e.mail: emartinez (añada @ cbm.uam.es)
Lcda Almudena Pacheco, becaria predoctoral
Lcda Paula Serrano, becaria predoctoral
Lcda. Noemí Fernández, becaria predoctoral
Sr Jorge Ramajo, técnico laboratorio
Actividad Científica
Líneas de Investigación:
Bases moleculares de la iniciación interna de la traducción en RNAs mensajeros eucarióticos.
La iniciación interna facilita la traducción de RNAs mensajeros eucarióticos específicos, aún en condiciones de estrés celular o en etapas de inactividad nuclear en las que la iniciación dependiente de cap está fuertemente inhibida. Estos RNAs se caracterizan por disponer de una región 5´ no traducida larga y fuertemente estructurada en la que se localiza un elemento que actúa en cis, denominado sitio de entrada interna del ribosoma (IRES). El objetivo de nuestro grupo es entender como desempeñan la misma función elementos IRES que tienen secuencias diferentes, sin aparente conservación de su estructura. Para conseguir este objetivo utilizamos como modelo IRES de picornavirus y flavivirus (FMDV y HCV) y esperamos extender el estudio a IRES de mRNAs celulares. En concreto nos interesa conocer:
1) la estructura secundaria y terciaria del IRES, teniendo en cuenta la posibilidad de que existan interacciones directas con el ribosoma,
2) la implicación de factores transactivadores, tanto factores de iniciación de la traducción como otras proteínas auxiliares que puedan modular la estructura del RNA y/o su capacidad de interaccionar con el ribosoma, explicando el tropismo de algunos IRES.
3) el efecto de la modificación de factores transactivadores en respuesta a estrés, así como factores involucrados en la recircularización del RNA a través de interacciones de los extremos 3´ y 5´ del mRNA.
Análisis de la relación entre estructura y función del IRES.
El entendimiento de la relación entre estructura y función es clave para poder diseñar estrategias específicas tendentes a inactivar estos elementos. Los IRES de picornavirus figuran entre los mejor caracterizados a nivel molecular. Cada IRES se subdivide en dominios estructurales cuya función, ya sea la interacción con factores proteicos o la organización espacial del IRES, guarda una estrecha relación con la estructura que poseen. A día de hoy, hay grandes lagunas en el papel que desempeña el dominio central, denominado 3 o I. Por un lado, parece ser un lugar de conexiones terciarias dentro del IRES, y por otro podría ser responsable de interacciones RNA-ribosoma. Hay 2 objetivos concretos en esta línea de trabajo:
1. Reconstitución de complejos de iniciación de la traducción in vitro y determinación de los resíduos del dominio central protegidos en estos complejos. Identificación de los componentes que producen el patrón de protección correspondiente en FMDV y EMCV.
2. Caracterización molecular del proceso de identificación del AUG funcional en el IRES de FMDV. Mientras que nuestro grupo ha publicado resultados que favorecen la entrada directa hasta el segundo AUG, otros grupos han sugerido el rastreo del ribosoma desde el sitio de contacto en el IRES hasta el AUG funcional, incluidos los 84 resíduos que separan los 2 codones de inicio de la traducción en FMDV. En este objetivo se pretende averiguar la influencia de la estructura de la region separadora así como de factores como eIF1A en la formación de complejos 48S activos sobre el segundo AUG funcional de FMDV, el usado mas eficientemente además de ser el único que no se puede eliminar sin alterar la viabilidad del RNA viral.
Vectores de expresión policistrónicos para células animales
El desarrollo de organismos modificados genéticamente conlleva la expresión de varios genes, siendo al menos uno de ellos un gen seleccionable, un gen suicida o un marcador de expresión. Los IRES constituyen una herramienta básica para diseñar vectores policistrónicos, en los que a partir de una única unidad de transcripción se sinteticen dos o más proteínas de forma simultánea. Este tipo de vectores son bioseguros aunque provengan de agentes infecciosos, dado que los IRES son fragmentos del mRNA que funcionan fuera de su contexto genético, y se pueden integrar en el cromosoma de las células de interés de forma que son útiles tanto en expresión transitoria como constitutiva. La actividad IRES es resistente a condiciones de estrés celular que conllevan la inhibición de la traducción dependiente de cap, facilitando la traducción del cistrón que les sigue aún en situaciones de estrés severas. Por otro lado, los IRES provenientes de distintos mRNAs interaccionan con proteínas específicas, lo que proporciona propiedades de tropismo celular en función de que las células dispongan de las proteínas transactivadoras específicas. Los objetivos concretos de esta línea de trabajo son:
1. Construcción de vectores policistrónicos por combinación de IRES virales y celulares.
2. Competición entre distintos IRES localizados en RNAs policistrónicos: interacción con proteínas específicas.
3. Caracterización funcional de la proteínas que interaccionan con los distintos IRES.
Es de esperar que la combinación de los resultados obtenidos nos proporcione una visión panorámica de la dinámica de complejos ribonucleoproteicos implicados en la actividad IRES.
Publicaciones más relevantes:
- López de Quinto, S., and Martínez-Salas, E. Involvement of the aphthovirus RNA sequence located between both functional AUGs in start codon selection. Virology 255, 324-336 (1999).
- Martínez-Salas, E. Internal ribosome entry site (IRES) biology and its use in gene expression vectors. Curr. Opin. Biotechnol. 10, 458-464 (1999).
- Ramos, R. and Martínez-Salas, E. Long-range interactions in aphthovirus internal ribosome entry site elements. RNA 5, 1374-1383 (1999)
- Ibarrola, N., Moreno-Monteagudo, J.A., Sáiz, M., García-Monzón, C., Sobrino, F., García-Buey, L., Lo Iacono O., Moreno-Otero, R., and Martínez-Salas, E. Response to retreatment with interferon-alpha plus ribavirin in chronic hepatitis C patients is independent of the NS5A gene nucleotide sequence. Am. J. Gastroenterol. 94, 2487-2495 (1999).
- Sáiz, J-C., López de Quinto, S., Ibarrola, N., López-Labrador, F-X., Sánchez-Tapias, J-M., Rodés, J., and Martínez-Salas, E. Internal initiation of translation efficiency in different hepatitis C genotypes isolated from Interferon responder and non-responder patients. Arch. Virol. 144, 1-15 (1999).
- Bigeriego, P., Rosas, M.F., Zamora, E., Martínez-Salas, E., and Sobrino, F. Heterotypic inhibition of foot-and-mouth disease virus infection by combinations of RNA transcripts corresponding to the 5´ and 3´ regions. Antiviral Res. 44, 133-141 (1999).
- López de Quinto S., and Martínez-Salas, E. Interaction of the eIF4G initiation factor with the aphthovirus IRES is essential for internal translation initiation in vivo. RNA 6, 1380 -1392 (2000).
- López de Quinto, S., Lafuente, E., and Martínez-Salas, E. IRES interaction with translation initiation factors: functional characterization of novel RNA contacts with eIF3, eIF4B, and eIF4GII. RNA 7, 1213-1226 (2001).
- Martínez-Salas, E., Ramos, R., Lafuente, E., and López de Quinto, S., Functional interactions in internal translation initiation directed by viral and cellular IRES. J. Gen. Virol. 82, 973-984 (2001)
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- Schneider R, et al., New ways of initiating translation in eukaryotes? Mol. Cell. Biol. 21, 8238-8246 (2001)
- López de Quinto, S., Sáiz, M.; de la Morena, D., Sobrino, F., and Martínez-Salas, E. IRES-driven translation is stimulated by the FMDV 3´NCR and poly(A) sequences Nuc. Acids Res. 30, 4398-4405 (2002)
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- Martínez-Salas, E., López de Quinto, S., Ramos, R., and Fernández-Miragall, O. IRES elements: features of the RNA structure contributing to their activity Biochimie 84, 755-763 (2002).
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