Grupo Terapia anticancerosa

 

Responsable: Carlos J Ciudad

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Facultad de Farmacia

Universidad de Barcelona.

Av. Diagonal 643

08028 Barcelona

 

Teléfono: 93 4034455       Fax: 93 4024520

http://www.ub.edu/terapiamol/cancer/Welcome.html

 

 

Componentes del Grupo

 

Carlos J Ciudad, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular, cciudad@ub.edu

 

Verònica Noé, Postdoctoral,

 

Silvia Peñuelas, Becaria Predoctoral,

Silvia Coma, Becaria Predoctoral,

Alicia Tapias, Becaria Predoctoral,

 

 

Actividad Científica

 

Líneas de Investigación:

Utilizando RNA como objetivo de investigación desarrollamos dos lineas, una a nivel postranscripcional y otra a nivel terapéutico utilizando técnicas antisentido.

 

1.- Regulación postranscripcional de la dihidrofolato reductasa (DHFR)

Estudiamos el control postranscripcional del mRNA para la DHFR y en concreto en el papel que juegan las secuencias intrónicas del gen en este tipo de regulación.

 

    Cuando se eliminan las secuencias intrónicas previamente a su transcripción, tal y como ocurre en la construcción de minigenes desprovistos de intrones, normalmente se obtienen unos niveles de mRNA muy bajos en la expresión de estos minigenes en células en cultivo o en animales transgénicos. Este procesamiento ineficaz del RNA puede deberse a la eliminación de secuencias “enhancer” presentes en los intrones, a una reducción de la estabilidad del RNA en el núcleo, a un desacoplamiento de su transporte hacia el citoplasma o a un proceso deficiente de poliadenilación del RNA. Sin embargo, y dado que en la mayoría de casos la ausencia de intrones comporta un bajo nivel de mRNA, solo existen algunos estudios que analicen la traducción de este mRNA transcrito en ausencia de secuencias intrónicas a proteína.

 

    En el caso de minigenes para la dihidrofolato reductasa (DHFR) se ha observado que la presencia de secuencias intrónicas es necesaria para una transfección eficiente de dichos minigenes. Nuestro principal objetivo consiste en estudiar por qué la presencia de un intrón en la secuencia de DNA de una construcción quimérica es esencial para obtener altos niveles de expresión de la proteína codificada por la construcción.

    Hemos podido determinar que la distribución celular del mRNA no se ve alterada por la ausencia de intrones en el minigen correspondiente.  Asímismo, el mRNA transcrito tanto en presencia como en ausencia de un intrón se poliadenila corectamente.

Finalmente hemos observado que la capacidad de traducción del mRNA transcrito a partir de un minigen portador de un intrón es superior a la resultante del mismo minigen desprovisto de esta secuencia intrónica. Además, la estabilidad de la proteína traducida a partir del mRNA procedente del minigen con intrón es también superior.

Nuestro próximo objetivo es investigar el mecanismo por el cual el proceso de splicing confiere una mayor estabilidad a la proteína traducida que la que exhibe cuando se traduce un mRNA que no ha pasado por empalmamiento.

 

    2.- Terapia antisentido

Dentro del capítulo de terapia antisentido aplicamos dos estrategias. La primera, en términos cronológicos, ha sido la utilización de oligonucleótidos antisentido. Para ello hemos empleado el modelo de la DHFR. Los oligonucleótidos más efectivos están dirigidos contra el inicio de la traducción, contienen la modificación fosfotiolato en enlaces fosfodiester específicos y son introducidos intracelularmente mediante liposomas catiónicos. Los niveles de RNA para la DHFR son decrementados indicando una activación de la RNAsa H y se traducen en una disminución en los niveles de proteína detectados por Western blot y en la actividad enzimática asociada. El ataque mediante oligonucleótidos antisentido contra la DHFR conduce a la muerte celular de manera irreversible después de 48-72 horas de tratamiento. Adicionalmente, hemos podido direccionar estos oligonucleótidos de manera específica a células humanas de cáncer de mama mediante la utilización de inmunoliposomas portadores de anticuerpos contra HER-2.

 

La segunda estrategia utilizada es la del RNA de interferencia. Para ello hemos sintetizado mediante transcripción “in vitro” secuencias de RNA de doble cadena con la estructura AA(N19)TT dirigidas contra el RNA de la proteína antiapoptótica Survivina. Las secuencias diana se situaban tanto en la zona codificante como en la región 3’-UTR. Posteriormente, estas secuencias han sido introducidas intracelularmente mediante liposomas catiónicos comerciales (Ambion).

 

Hemos detectado que los siRNAs utilizados no solamente provocaban apoptosis sino una disminución en parámetros angiogénicos como son la migración y la formación de capilares, además de causar un bloqueo en la fase S del ciclo celular, todo ello a concentraciones de siRNA del orden de nM. Con la utilización de siRNA como “herramienta” hemos podido validar funciones celulares de la Survivina y comprobar que la inhibición de la expresión de la misma constituye una posible acción terapéutica anticancerosa por reunir las propiedades de causar efectos pro-apoptóticos y antiangiogénicos.

 

Nuestros próximos objetivos en este campo son utilizar vectores que produzcan intracelularmente los siRNAs y extender nuestra investigación a otras posible dianas terapéuticas.