Grupo Terapia
anticancerosa
Responsable: Carlos J Ciudad
Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular
Facultad
de Farmacia
Universidad
de Barcelona.
Av.
Diagonal 643
08028
Barcelona
Teléfono:
93 4034455 Fax: 93 4024520
http://www.ub.edu/terapiamol/cancer/Welcome.html
Componentes del Grupo
Carlos
J Ciudad, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular, cciudad@ub.edu
Verònica
Noé, Postdoctoral,
Silvia
Peñuelas, Becaria Predoctoral,
Silvia
Coma, Becaria Predoctoral,
Alicia
Tapias, Becaria Predoctoral,
Actividad Científica
Líneas
de Investigación:
Utilizando RNA como objetivo de investigación desarrollamos dos lineas, una
a nivel postranscripcional y otra a nivel terapéutico utilizando técnicas
antisentido.
1.- Regulación postranscripcional
de la dihidrofolato reductasa (DHFR)
Estudiamos el control
postranscripcional del mRNA para la DHFR y en concreto en el papel que juegan
las secuencias intrónicas del gen en este tipo de regulación.
Cuando
se eliminan las secuencias intrónicas previamente a su transcripción, tal y
como ocurre en la construcción de minigenes desprovistos de intrones,
normalmente se obtienen unos niveles de mRNA muy bajos en la expresión de estos
minigenes en células en cultivo o en animales transgénicos. Este procesamiento
ineficaz del RNA puede deberse a la eliminación de secuencias “enhancer”
presentes en los intrones, a una reducción de la estabilidad del RNA en el
núcleo, a un desacoplamiento de su transporte hacia el citoplasma o a un
proceso deficiente de poliadenilación del RNA. Sin embargo, y dado que en la mayoría
de casos la ausencia de intrones comporta un bajo nivel de mRNA, solo existen
algunos estudios que analicen la traducción de este mRNA transcrito en ausencia
de secuencias intrónicas a proteína.
En
el caso de minigenes para la dihidrofolato reductasa (DHFR) se ha observado que
la presencia de secuencias intrónicas es necesaria para una transfección
eficiente de dichos minigenes. Nuestro principal objetivo consiste en estudiar
por qué la presencia de un intrón en la secuencia de DNA de una construcción
quimérica es esencial para obtener altos niveles de expresión de la proteína
codificada por la construcción.
Hemos
podido determinar que la distribución celular del mRNA no se ve alterada por la
ausencia de intrones en el minigen correspondiente. Asímismo, el mRNA transcrito tanto en presencia como en ausencia
de un intrón se poliadenila corectamente.
Finalmente hemos observado que la capacidad
de traducción del mRNA transcrito a partir de un minigen portador de un intrón
es superior a la resultante del mismo minigen desprovisto de esta secuencia
intrónica. Además, la estabilidad de la proteína traducida a partir del mRNA
procedente del minigen con intrón es también superior.
Nuestro próximo objetivo es investigar el
mecanismo por el cual el proceso de splicing confiere una mayor estabilidad a
la proteína traducida que la que exhibe cuando se traduce un mRNA que no ha
pasado por empalmamiento.
2.- Terapia antisentido
Dentro del capítulo de terapia antisentido aplicamos dos
estrategias. La primera, en términos cronológicos, ha sido la utilización de
oligonucleótidos antisentido. Para ello hemos empleado el modelo de la DHFR.
Los oligonucleótidos más efectivos están dirigidos contra el inicio de la
traducción, contienen la modificación fosfotiolato en enlaces fosfodiester
específicos y son introducidos intracelularmente mediante liposomas catiónicos.
Los niveles de RNA para la DHFR son decrementados indicando una activación de
la RNAsa H y se traducen en una disminución en los niveles de proteína detectados
por Western blot y en la actividad enzimática asociada. El ataque mediante
oligonucleótidos antisentido contra la DHFR conduce a la muerte celular de
manera irreversible después de 48-72 horas de tratamiento. Adicionalmente,
hemos podido direccionar estos oligonucleótidos de manera específica a células
humanas de cáncer de mama mediante la utilización de inmunoliposomas portadores
de anticuerpos contra HER-2.
La segunda estrategia utilizada es la del RNA de
interferencia. Para ello hemos sintetizado mediante transcripción “in vitro” secuencias de RNA de doble
cadena con la estructura AA(N19)TT dirigidas contra el RNA de la proteína
antiapoptótica Survivina. Las secuencias diana se situaban tanto en la zona
codificante como en la región 3’-UTR. Posteriormente, estas secuencias han sido
introducidas intracelularmente mediante liposomas catiónicos comerciales
(Ambion).
Hemos detectado que los siRNAs utilizados no solamente
provocaban apoptosis sino una disminución en parámetros angiogénicos como son
la migración y la formación de capilares, además de causar un bloqueo en la
fase S del ciclo celular, todo ello a concentraciones de siRNA del orden de nM.
Con la utilización de siRNA como “herramienta” hemos podido validar funciones
celulares de la Survivina y comprobar que la inhibición de la expresión de la
misma constituye una posible acción terapéutica anticancerosa por reunir las
propiedades de causar efectos pro-apoptóticos y antiangiogénicos.
Nuestros próximos objetivos en este campo son utilizar vectores
que produzcan intracelularmente los siRNAs y extender nuestra investigación a
otras posible dianas terapéuticas.