Responsable:
Montserrat Bach Elías
Centro de Investigación Cardiovascular CSIC-ICCC
C/Jorge Girona Salgado 18-26
08034
Barcelona
Teléfono:
93 400 61 34 Fax: 93 204 59 04
Montserrat Bach
Elías, Científico titular, mbebmc@cid.csic.es
María Camats Malet, Investigadora
Contratada,mcmbmc@ibmb.csic.es
Guillem Plasencia, Becario
Predoctoral, GUILLEMP@teleline.es
Gemma
Garrido Garcia, Becario Predoctoral, gema_garrido@hotmail.com
Actividad Científica
Líneas de Investigación:
A)
P19 H-RAS
Nuestro grupo ha descubierto recientemente la proteína
p19 H-Ras humana producto del splicing alternativo del pre-mRNA de c-H-Ras. La
proteína no había sido descubierta hasta ahora debido a que era necesaria “una
mirada intrónica” del problema, “mirada“ que nosotros pudimos aportar gracias a
nuestra experiencia en splicing y splicing alternativo en células humanas. Esta
proteína se diferencia de p21 H-Ras en que no une GTP, no interacciona con Raf1
o Rin pero se une a RACK1 (receptor de varias proteínas, entre ellas las PKCs.
Además no se encuentra anclada en la parte interna de la membrana, sino que se
distribuye por el citoplasma y núcleo. Estamos siguiendo este trabajo para
poder descifrar la función de l p19 H-Ras y su papel en el núcleo.
B)
Trans-splicing
natural en mamíferos
Este trabajo es una línea del Dr. Fausto G.
Hegardt de la UB de Barcelona en la cual nosotros participamos con los ensayos
in vitro de trans-splicing. En el año 1998 el grupo de Dr. Hegardt y nosotros
descubrimos el primer gen (COT) que sufría trans-splicing natural en células de
rata. Desde entonces hemos estado caracterizado este trans-splicing, siendo lo
más relevante es descubrimiento de mutantes naturales que no realizaban este
trans-splicing. Estos mutantes pusieron en evidencia que las cajas GAAGAAG de
los exones de la COT son muy importantes para este trans-splicing natural.
Actualmente estamos estudiando factores específicos que regulen el
trans-splicing de la COT.
C)
Regulación del
splicing alternativo de genes de gran interés médico
Nuestro principal trabajo actual es estudiar
cómo se regulan ciertos genes mediante el splicing alternativo. Entre ellos,
estamos estudiando el gen c-H-ras y su
splicing alternativo del exón IDX. Hemos descubierto que las proteínas SRs,
hnRNP A1, hnRNP H, FUS/TLS y p68 RNA helicasa son posibles reguladores de este
splicinf alternativo. Además hemos observado que una estructura secundaria
(stem-loop) compuesta por el exón IDX y parte del intrón D2 3’ adyacente
regulan la inclusión o no de IDX, regulando así un proceso de carcinogénesis ya
que la inclusión de IDX es menos tumorigénica cuando el gen H-ras está activado.
Publicaciones (1999-2003)
- Sònia Guil, Núria De La Iglesia, Juan Fernández-Larrea, Juan C.
Ferrer, Joan J. Guinovart and Montse
Bach-Elias. (2003). Alternative splicing of the human
proto-oncogene c-H-ras renders a new
Ras family protein which trafficks to cytoplasm and nucleus. Cancer
Research 63, 5178-5187.
- Montse Bach-Elias and
Sònia Guil. (2003). Alternative splicing: a
key for the gene expression. Recent Research Developments in Biophysics
and Biochemistry 3, 385-426.
ISBN:81-271-0014-5.Research
Signpost Kerala, India.
- Sònia Guil,
Renata Gattoni, Montserrat Carrascal, Joaquín Abian, James Stévenin and Montse Bach-Elias. (2003).
HnRNP A1 and SR proteins regulate the alternative splicing of proto-oncogen c-H-ras, balancing the relative abundance
of two alternative H-Ras proteins, p19 and p21. Molecular and Cellular
Biology 23, 2927-2941.
- Patente de Invención. Título: El uso de la proteína p19 H-Ras.
Inventores: Sònia Guil, Juan B. Fernández-Larrea y Montse Bach-Elias
Presentada en la Oficina Española de Patentes y Marcas el 18 de abril
del 2002 (12:21:41). Nº P200200900).
- Sònia Guil, Edward
Darzynkiewicz and Montse
Bach-Elias. (2002). Study of the 2719 mutant of the c-H-ras oncogen in a bi-intronic
alternative splicing system. Oncogene 21, 5649-5653.
- Hegardt, F.G., Bach, M., Asins, G., Caudevilla, C.,
Morillas, M, Codony C. Y Serra D. (2001). Post-transcriptional regulation of
rat carnitine octanoyltransferase. Biochem. Soc. Trans., 29 (2) p316-320.
- (*) Concha Caudevilla, (*)
Carles Codony, Dolors Serra, Guillem Plasencia, Ruth Román, Adlf Graessmann,
Guillermina Asins, Montserrat Bach-Elias
and Fausto G. Hegardt. (2001). Localization of an exonic splicing enhancer
responsible for mammalian natural trans-splicing. (2001) Nucleic Acids
Research, volume 29 (14) p3108-3115.
(*) Ambos autores comparten la primera plaza de autoría, siendo la Dra. Caudevilla
miembro del grupo del Dr. F.G. Hegardt y el Dr. Codony, miembro de grupo de la
Dra. Bach.
- Carles Codony, Sonia Guil,
Concha Caudevilla, Dolors Serra,
Guillermina Asins, Adolf Graessmann and Montse
Bach-Elias. (2001). Modulation in vitro of H-ras oncogene expresión by
trans-splicing. (2001)
Oncogene Jun 21; 20(28) p3683-3694.
- Sònia Guil, Carles Codony, M. Angeles Chesa, Ramón
Eritja, Ed Darzynkiewicz and Montse Bach-Elias. (2000). Alternative
splicing of c-H-ras, a system to study
different aspects of the splicing mechanism. Instituto Juan March de estudios e Investigaciones.
Regulation
of Messenger RNA processing page 67.
- C.
Caudevilla, D. Serra, A. Miliar, G. Asins, C. Codony, M. Bach y F.G. Hegardt. (1999). Processing of carnitine
octanoyltransferase pre-mRNAs by cis and
trans-splicing. Current Views of Fatty Acid Oxydation and Ketogenesis:
From Organelles to Point Mutations edited by Quant and Eaton, Kluwer
Academic/Plenum Publishers, New York, pp95-102.
- Diana Bahia, Josep Font, Amina
Khaouja, Narcís Carreras, Ruth Espuny,
Regina Maria. Barretto Cicarelli, Miguel Ingelmo and Montse Bach-Elias. (1999). Sm motif 1
is immunolgically conserved, European Journal of Biochemistry 261, 371-378.
- Ruth Espuny, Diana Bahia, Regina Maria
Barretto Cicarelli, Carles Codony, Amina Khaouja, Anna Maria Aviñó, Ramón
Eritja y Montse Bach-Elias. (1999).
Preparation of N2,N2-7-trimetilguanosine affinity columns
Nucleosides & Nucleotides Vol. 18
(1) pp 125-136.
Instituto de
Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC
Ventanilla nº11
18001-Granada
Teléfono: 958 80
51 87 Fax: 958 20 39 11
Alfredo Berzal
Herranz, Científico Titular, aberzalh@ipb.csic.es
Alicia Barroso del
Jesús, Postdoctoral, abarroso@ipb.csic.es
Elena Puerta
Fernández, Postdoctoral, elenap@ipb.csic.es
Cristina Romero
López, Becaria Predoctoral, Cristina_Romero@ipb.csic.es
Vicente Augustin
Vacas, Ayudante de Investigación
El
trabajo del grupo esta fundamentalmente dedicado a la caracterización de RNAs
catalíticos y su uso como inactivadores génicos.
Una
de las aproximaciones más atractivas para conseguir un bloqueo o inactivación
específica de la expresión génica es el empleo de ácidos nucleicos. El uso de
ácidos nucleicos en general y de RNAs en particular como inactivadores génicos
y agentes terapéuticos tiene una ventaja añadida y es que a diferencia de otros
fármacos tremendamente agresivos y carentes de especificidad celular para los
que la barrera entre la dosis terapéutica y la tóxica es muy laxa, las
moléculas de RNA tienen una gran especificidad determinada por complementariedad
de secuencia y actúan directamente sobre la información genética contra la que
se dirigen.
El
interés del laboratorio es el diseño de estrategias basadas en el uso de RNAs
como inactivadores de la función génica. Utilizamos RNAs catalíticos o ribozimas
como base para el desarrollo de los RNAs inhibidores. Está ampliamente
demostrado la capacidad de estas moléculas para inactivar específicamente otra
molécula de RNA contra la cual se dirigen. No obstante y a pesar de lo
alentador de los trabajos realizados hasta la fecha los mismos ponen de
manifiesto una serie de limitaciones que obligan a ahondar en la optimización
de los dominios catalíticos y sus estrategias de empleo.
Una
de las aproximaciones experimentales que hemos seguido ha sido la construcción
de moléculas híbridas que combinan un dominio catalítico (tipo hairpin o
hammerhead) con un dominio antisense que facilite la unión del ribozima a su
diana específica. Estos RNAs se denominan RNAs antisense catalíticos. Así hemos
demostrado utilizando como modelo la región LTR del VIH-1 que la presencia en
el RNA inhibidor de un dominio complementario a la región TAR del VIH potencia
la degradación del RNA viral tanto por RNAs derivados de la ribozima hairpin
como hammerhead. Estos ensayos se han realizado utilizando distintas dianas de
acción de las ribozimas. Actualmente estamos interesados en la caracterización
de RNAs inhibidores que puedan ser utilizados como agentes antivirales. Como
sistemas modelo utilizamos el VIH y el VHC.
Con
este segundo virus hemos iniciado un proyecto que tiene como fin el diseño de
RNAs inhibidores dirigidos a la región 5’-UTR del VHC. Los dominios catalíticos
a ensayar son igualmente del tipo hairpin y hammerhead. El diseño de los
dominios antisense se hace mediante una estategia de selección de aptámeros a
partir de poblaciones aleatorias de moléculas de RNA. Seleccionando moléculas
que se unen eficientemente a la región 5’-UTR del genoma viral y a su vez son
capaces de procesar dicho RNA.
Este
tipo de modificación de los RNAs catalíticos además de potenciar o facilitar la
asociación de los mismos a sus RNAs substratos, implican la combinación de dos
actividades inhibidoras en una misma molécula, una actividad de procesamiento
del RNA que se quiere inactivar y una actividad antisense sobre la región del
RNA portadora del dominio de anclaje, lo cual podría conducir a una mayor
actividad inhibitoria per se. Por otra parte esto podría dificultar el escape a
estos dominios inhibidores por separado debido a la aparición de mutaciones.
Finalmente
estamos interesados en la optimización de estos inhibidores mediante la
combinación de la actividad catalítica con la actividad “decoy” que presentan
algunas moléculas de RNA; capacidad para unir específicamente un factor
(proteico generalmente) importante para la expresión de un gen. El uso de estos
RNAs como inhibidores ha sido ensayado con éxito como moléculas aisladas.
Nosotros pretendemos construir moléculas híbridas que denominamos
ribodecozimas, que combinan un dominio catalítico derivado de las ribozimas
naturales tipo hairpin o hammerhead y un dominio decoy. En primer lugar
queremos caracterizar la aplicabilidad de estas moléculas como inhibidores de
la replicación del VIH, para lo cual hemos diseñado dominios decoy del TAR y
del RRE capaces de unir específicamente las proteínas Tat y Rev importantes
para la replicación viral.
BMC2003-00669 MCyT. Inactivación Génica Mediada por
RNAS Catalíticos: Caracterización de Ribozimas de Segunda Generación.
Diciembre
2003/ Diciembre 2006
Investigador
Principal: Alfredo Berzal Herranz
36266/02
FIPSE. RNAs Catalíticos, una nueva herramienta para la Investigación sobre VIH.
Identificación de Nuevas Dianas en el Genoma del Virus.
Octubre
2002/Octubre 2005
Investigador
Principal: Alfredo Berzal Herranz
-
Barroso-delJesus, A., Puerta-Fernández, E., Romero-López, C., Tapia, N.,
Martínez, M.A. and Berzal-Herranz, A. (2004) Inhibition of HIV-1 replication by second
generation anti-HIV ribozymes. Enviado para su publicación.
-
Barroso-delJesus, A., Romero-López, C. Puerta-Fernández, E. and Berzal-Herranz, A. (2004). An
experimental method for selecting effective target sites and designing hairpin
ribozymes. In Methods in Molecular Biology, Vol. 252, Ribozymes and
siRNA protocols (Second edition). Ed M. Sioud. Humana Press Inc., Totowa, NJ.,
USA (En prensa).
-
Romero-López, C. Barroso-delJesus, A., Puerta-Fernández, E. and Berzal-Herranz, A. (2004). Design and
optimization of sequence-specific hairpin ribozymes. In Methods in Molecular Biology, Vol. 252, Ribozymes and
siRNA protocols (Second edition). Ed M. Sioud. Humana Press Inc., Totowa, NJ.,
USA (En prensa).
-
Puerta-Fernández, E., Romero-López, C., Barroso-delJesus, A. and Berzal-Herranz, A. (2003). Ribozymes:
Recent Advances in the Development of RNA Tools. FEMS Microbiology Reviews, 27: 75-97.
-
Nacheva, G. and Berzal-Herranz, A. (2003). Preventing
non-desired RNA-primed RNA extension catalyzed by T7 RNA Polymerase. European Journal of Biochemistry, 270:
1458-1465.
-
Puerta-Fernández, E., Barroso-delJesus, A., Romero-López, C. and Berzal-Herranz,
A. (2003). HIV-TAR as anchoring site for optimized catalytic RNAs. Biol. Chem., 384: 343-350.
-
Puerta-Fernández, E., Barroso-delJesus, A. and Berzal-Herranz, A. (2002). Anchoring
hairpin ribozymes to long target RNAs by loop-loop RNA interactions. Antisense & Nucleic Acids Drug
Development, 12: 1-9.
-
Barroso-delJesus, A. and Berzal-Herranz,
A. (2001). Selection of targets and the most efficient hairpin ribozymes
for inactivation of mRNAs using a self-cleaving RNA library. EMBO reports, 2: 1113-1119.
-
Pérez-Ruiz, M., Barroso-delJesus, A. and Berzal-Herranz,
A. (1999). Specificity of the hairpin ribozyme: Sequence requirements surrounding
the cleavage site. J. Biol. Chem., 274: 29376-29380.
-
Barroso-delJesus, A., Tabler M. and Berzal-Herranz,
A. (1999). Comparative kinetic analysis of structural variants of the
hairpin ribozyme reveals further potential to optimize its catalytic
performance. Antisense & Nucleic Acid
Drug Development, 9: 433-440.
- Pérez-Ruiz, M.,
Sievers, D., García-López, P.A. and Berzal-Herranz,
A. (1999). The antisense sequence of the HIV-1 TAR stem-loop structure
covalently linked to the hairpin ribozyme enhances its catalytic activity
against two artificial substrates. Antisense
& Nucleic Acid Drug Development, 9:
33-42.
Responsable: Carlos J Ciudad
Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular
Facultad
de Farmacia
Universidad
de Barcelona.
Av.
Diagonal 643
08028
Barcelona
Teléfono:
93 4034455 Fax: 93 4024520
http://www.far.ub.es/~tarimel/bq/DHFR.html
Componentes del Grupo
Carlos
J Ciudad, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular, cciudad@ub.edu
Verònica
Noé, Postdoctoral,
Silvia
Peñuelas, Becaria Predoctoral,
Silvia
Coma, Becaria Predoctoral,
Alicia
Tapias, Becaria Predoctoral,
Actividad Científica
Líneas
de Investigación:
Utilizando RNA como objetivo de investigación desarrollamos dos lineas, una
a nivel postranscripcional y otra a nivel terapéutico utilizando técnicas
antisentido.
1.- Regulación postranscripcional
de la dihidrofolato reductasa (DHFR)
Estudiamos el control
postranscripcional del mRNA para la DHFR y en concreto en el papel que juegan
las secuencias intrónicas del gen en este tipo de regulación.
Cuando
se eliminan las secuencias intrónicas previamente a su transcripción, tal y
como ocurre en la construcción de minigenes desprovistos de intrones,
normalmente se obtienen unos niveles de mRNA muy bajos en la expresión de estos
minigenes en células en cultivo o en animales transgénicos. Este procesamiento
ineficaz del RNA puede deberse a la eliminación de secuencias “enhancer”
presentes en los intrones, a una reducción de la estabilidad del RNA en el
núcleo, a un desacoplamiento de su transporte hacia el citoplasma o a un
proceso deficiente de poliadenilación del RNA. Sin embargo, y dado que en la mayoría
de casos la ausencia de intrones comporta un bajo nivel de mRNA, solo existen
algunos estudios que analicen la traducción de este mRNA transcrito en ausencia
de secuencias intrónicas a proteína.
En
el caso de minigenes para la dihidrofolato reductasa (DHFR) se ha observado que
la presencia de secuencias intrónicas es necesaria para una transfección
eficiente de dichos minigenes. Nuestro principal objetivo consiste en estudiar
por qué la presencia de un intrón en la secuencia de DNA de una construcción
quimérica es esencial para obtener altos niveles de expresión de la proteína
codificada por la construcción.
Hemos
podido determinar que la distribución celular del mRNA no se ve alterada por la
ausencia de intrones en el minigen correspondiente. Asímismo, el mRNA transcrito tanto en presencia como en ausencia
de un intrón se poliadenila corectamente.
Finalmente hemos observado que la capacidad
de traducción del mRNA transcrito a partir de un minigen portador de un intrón
es superior a la resultante del mismo minigen desprovisto de esta secuencia
intrónica. Además, la estabilidad de la proteína traducida a partir del mRNA
procedente del minigen con intrón es también superior.
Nuestro próximo objetivo es investigar el
mecanismo por el cual el proceso de splicing confiere una mayor estabilidad a
la proteína traducida que la que exhibe cuando se traduce un mRNA que no ha
pasado por empalmamiento.
2.- Terapia antisentido
Dentro del capítulo de terapia antisentido aplicamos dos
estrategias. La primera, en términos cronológicos, ha sido la utilización de
oligonucleótidos antisentido. Para ello hemos empleado el modelo de la DHFR.
Los oligonucleótidos más efectivos están dirigidos contra el inicio de la
traducción, contienen la modificación fosfotiolato en enlaces fosfodiester
específicos y son introducidos intracelularmente mediante liposomas catiónicos.
Los niveles de RNA para la DHFR son decrementados indicando una activación de
la RNAsa H y se traducen en una disminución en los niveles de proteína detectados
por Western blot y en la actividad enzimática asociada. El ataque mediante
oligonucleótidos antisentido contra la DHFR conduce a la muerte celular de
manera irreversible después de 48-72 horas de tratamiento. Adicionalmente,
hemos podido direccionar estos oligonucleótidos de manera específica a células
humanas de cáncer de mama mediante la utilización de inmunoliposomas portadores
de anticuerpos contra HER-2.
La segunda estrategia utilizada es la del RNA de
interferencia. Para ello hemos sintetizado mediante transcripción “in vitro” secuencias de RNA de doble
cadena con la estructura AA(N19)TT dirigidas contra el RNA de la proteína
antiapoptótica Survivina. Las secuencias diana se situaban tanto en la zona
codificante como en la región 3’-UTR. Posteriormente, estas secuencias han sido
introducidas intracelularmente mediante liposomas catiónicos comerciales
(Ambion).
Hemos detectado que los siRNAs utilizados no solamente
provocaban apoptosis sino una disminución en parámetros angiogénicos como son
la migración y la formación de capilares, además de causar un bloqueo en la
fase S del ciclo celular, todo ello a concentraciones de siRNA del orden de nM.
Con la utilización de siRNA como “herramienta” hemos podido validar funciones
celulares de la Survivina y comprobar que la inhibición de la expresión de la
misma constituye una posible acción terapéutica anticancerosa por reunir las
propiedades de causar efectos pro-apoptóticos y antiangiogénicos.
Nuestros próximos objetivos en este campo son utilizar vectores
que produzcan intracelularmente los siRNAs y extender nuestra investigación a
otras posible dianas terapéuticas.
Grupo Control de
enfermedades virales en plantas: mecanismos de silenciamiento
génico
y resistencia transgénica a virus
Centro de
Investigaciones Biologicas, CSIC
Ramiro de Maeztu,
9
28040 Madrid
Teléfono: 91 837
3112 Fax: 91 536 04 32
http://www.cib.csic.es/virusvegetales/virusvegetales_es.html
José Ramón
Díaz-Ruiz Alba, Profesor de Investigación, jrdiazruiz@cib.csic.es
Francisco Tenllado
Peralo, Científico Titular, Tenllado@cib.csic.es
César Llave
Correas, Científico Titular, cesarllave@cib.csic.es
Félix Alejandro Atencio, Becario Predoctoral, felixale@cib.csic.es
Marisol Vargas Concha, Becaria Predoctoral, mvargas@cib.csic.es
Daniel
Barajas Ramírez, Becario Predoctoral, danibr@cib.csic.es
Líneas de Investigación:
Numerosas
secuencias de genes, derivadas de muchos virus de plantas diferentes, se han
introducido en una gran variedad de especies de plantas, para producir plantas
transgénicas protegidas frente a la infección por estos virus, una estrategia
conocida como resistencia transgénica derivada del patógeno. En muchos casos,
se sabe que el mecanismo de la resistencia es un proceso posttranscripcional,
mediado por RNA, que señaliza, de una forma específica de secuencia, tanto al
RNA viral como al mRNA del transgén, para su degradación. Esta resistencia a
virus mediada por RNA es una manifestación del silenciamiento génico
posttranscripcional (PTGS), un potente mecanismo de degradación intracelular de
RNA que probablemente ha evolucionado como una defensa de las plantas frente a
infecciones virales. PTGS tiene lugar también en plantas no transgénicas pero
los virus contraatacan esta respuesta de defensa natural del huésped
codificando en sus genomas supresores de PTGS. Esto parece ser una estrategia
ampliamente distribuida y usada por los virus de plantas tanto RNA como DNA.
Se
conocen también procesos mecanísticamente similares en animales (RNA
interferencia, RNAi) y este sistema de degradación de RNA dependiente de
homología parece operar como un mecanismo conservado que actúa frente a
parásitos moleculares en casi todos, si no todos, los eucariotas. Además, se
sospecha ampliamente que RNAi puede también servir como un sistema antiviral en
vertebrados. El RNA de doble cadena (dsRNA) es ampliamente reconocido como el
inductor de estos procesos de silenciamiento de RNA en plantas y animales, y el
silenciamiento de genes diana se puede inducir en una variedad de organismos
suministrando moléculas homólogas de dsRNA.
En
esta línea, nuestro grupo mantiene, durante los últimos años, un programa de
investigación orientado hacia el control de enfermedades virales en plantas.
Recientemente, el énfasis se ha puesto en: 1) el análisis de estrategias de
resistencia transgénica a virus en plantas, derivada del patógeno, y la
elucidación de los mecanismos celulares y moleculares que controlan la
resistencia; 2) el análisis del mecanismo de defensa antiviral en plantas
mediado por silenciamiento génico y el estudio de los supresores virales de
silenciamiento génico y 3) el análisis del mecanismo de interferencia con las
infecciones virales en plantas inducido por dsRNA.
Proyectos en vigor:
BIO2000-0914. MCyT. Estudio del mecanismo de defensa
antiviral mediado por silenciamiento genico y su aplicacion al control de
enfermedades virales en plantas. 2000-2003. Investigador Principal: José Ramón
Díaz-Ruiz Alba
07G/0043/2003. Comunidad de Madrid. Nuevas estrategias de control de las enfermedades virales en plantas basadas en silenciamiento génico que redunden en una mejora de las variedades vegetales. 2003-2004. Investigador Principal: Francisco Tenllado Peralo.
BIO2003-03428. MCyT. Diseño y evaluación de nuevos bioplaguicidas basados en silenciamiento génico. 2004-2007. Investigador Principal: José Ramón Díaz-Ruiz Alba
Publicaciones relevantes
(1999-2003):
- Tenllado, F. and Díaz-Ruíz, J. R. Complete
resistance to pepper mild mottle tobamovirus mediated by viral replicase
sequences partially depends on transgene homozygosity and is based on a gene
silencing mechanism. Transgenic Research. 8, 83-93, 1999.
- Llave, C. Kasschau K. D and Carrington, J. C.
Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a
maintenance step in the silencing pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,
13401-13406, 2000.
- Tenllado, F., and Bol, J.F. Genetic
dissection of the multiple functions of alfalfa mosaic virus coat protein in
viral RNA replication, encapsidation and movement. Virology 268, 29-40,
2000.
- Tenllado, F. and Díaz-Ruíz, J. R.
Double-stranded RNA-mediated interference with plant virus infection. J.
Virol. 75, 12288-12297, 2001.
- Llave, C. Kasschau K. D Rector, M.A. and
Carrington, J. C. Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants. The
Plant Cell 14, 1605-1619, 2002.
- Llave, C.. Xie, Z., Kasschau K. D and
Carrington, J. C. Developmentally controlled cleavage of Scarecrow-like mRNA targets is directed by a class of Arabidosis miRNA. Science 297,
2053-2056, 2002.
- Tenllado, F., Barajas, D., Vargas, M.,
Atencio, F. A., González-Jara, P., and Díaz-Ruíz,
J. R. Transient expression of homologous hairpin RNA causes interference
with plant virus infection and is overcome by a virus encoded suppressor of
gene silencing. Mol. Plant-Microbe Interact. 16, 149-158, 2003
- Tenllado, F., Martinez-García, B, Vargas, M.,
and Díaz-Ruíz, J.R. Crude extracts of bacterially expressed dsRNA can be used
to protect plants against virus infections. BMC Biotechnology 2003 3:3,
2003.
- Kasschau KD, Xie Z, Allen E, Llave C, Chapman
EJ, Krizan KA and Carrington JC. P1/HC-Pro, a Viral Suppressor of RNA
Silencing, Interferes with Arabidopsis
Development and miRNA Function. Developmental Cell 4, 205-217, 2003.
- Tenllado, F., Llave, C., and Díaz-Ruíz, J.R.
RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases
in plants. Virus Res. (In Press).
- Llave, C., Tenllado, F., and
Díaz-Ruíz, J.R.. Gene
silencing and other small RNA-related processes as innovative molecular tools
for control of virus diseases in plants. In Emerging concepts in plant
health management. Edited by R. Lartey. Research Signpost. (In Press).
Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB),
CSIC.
Jordi Girona 18-26
08034 Barcelona
Teléfono 93-4006145 Fax
93-2045904
Ramon Eritja Casadellà, Investigador Científico, recgma@ibmb.csic.es
Marta Gutiérez Grimau, Becaria Predoctoral, mgggma@ibmb.csic.es
Actividad Científica
Líneas de
Investigación:
Los
ácidos nucleicos (ADN y ARN), constituidos por cadenas muy largas de
nucleótidos, tienen un papel fundamental de la transmisión genética. El
objetivo principal del grupo es el estudio de la metodología para la
preparación de oligonucleótidos y compuestos relacionados con los ácidos
nucleicos, así como, el estudio de sus propiedades. Las líneas de trabajo que
el grupo está desarrollando actualmente son las siguientes:
1)
Síntesis de oligonucleótidos modificados para su utilización en el ensamblaje
de nanomateriales. El objetivo de este proyecto, es el desarrollo de métodos
para la fabricación de dispositivos nanoelectrónicos haciendo uso de las
propiedades de autoensamblaje de las moléculas de ADN. En este proyecto, los
oligonucleótidos son utilizados para dirigir nanopartículas en una distribución
predeterminada, utilizando las reglas de apareamiento de los ácidos nucleícos
(A con T, G con C). Para esto, se deben unir nanopartículas a oligonucleótidos
de secuencia definida. Otros aspectos estudiados en colaboración con otros
grupos son el anclaje de oligonucleótidos a electrodos metálicos y el
recubrimiento selectivo del ADN con metales para obtener cables de diámetro muy
pequeño.
2)
Síntesis de oligonucleótidos que contienen 8-aminopurinas con propiedades
estabilizadoras de hélices triples. A parte de la estructura de hélice doble,
el ADN puede presentar una estructura de hélice triple en zonas de
polipurina-polipirimidina. En colaboración con el grupo del Dr. Orozco (U. de
Barcelona) hemos demostrado que la sustitución de adenina por 8-aminoadenina y
guanina por 8-aminoguanina estabiliza las hélices triples. Ya que estas
estructuras son muy útiles para el control de la expresión génica y para el
diagnóstico genético, se está investigando la estructura y las aplicaciones de
la hélices triples formadas 8-aminoadenina y 8-aminoguanina.
3)
Síntesis de conjugados oligonucleótido-péptido y de ácidos nucleicos peptídicos
(PNA). La posibilidad de unir péptidos y oligonucleótidos ha despertado un gran
interés ya que así. se pueden obtener compuestos que combinan las propiedades
exclusivas de los péptidos con las de los oligonucleótidos. Una de las
propiedades interesantes de ciertos péptidos es la capacidad de ser reconocidos
por anticuerpos. De esta manera, se pueden sintetizar moléculas híbridas
oligonucleótido-péptido que pueden unirse a secuencias complementarias y, a su
vez, ser reconocidas por anticuerpos específicos. Otras propiedades de los
péptidos que desearíamos incorporar a los conjugados oligonucleótido-péptido
serían facilitar la entrada celular y una mejora de las propiedades de
hibridación. Los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) son análogos sintéticos de
los oligonucleótidos donde el esqueleto de ribosa fosfato se ha reemplazado por
un esqueleto de poliamida. Aunque el cambio estructural es grande los PNA
poseen una mayor capacidad de apareamiento que los oligonucleótidos naturales.
Por estas razones, el grupo tiene interés en preparar PNA con análogos de las
bases con propiedades peculiares.
Además
de las temas indicados, el grupo posee una larga experiencia en síntesis de
péptidos y en síntesis de oligonucleótidos modificados. Es de destacar la
experiencia del grupo en la síntesis de oligonucleótidos con bases no
naturales, con enlaces internucleotídicos modificados (fosforotioato,
metilfosfonato) y en el marcaje no radioactivo de oligonucleótidos. Finalmente
el grupo también tiene experiencia en síntesis de ARN natural y modificado.
- Soliva, R.,
Güimil García, R., Blas, J.R., Eritja, R., Asensio, J.L., González, C., Luque,
F.J., Orozco, M. (2000) “DNA-triplex stabilizing properties of
8-aminoguanine.” Nucleic Acids Res., 28: 4531-4539.
- Cubero, E., Güimil García, R., Luque, F.J., Eritja,
R., Orozco, M. (2001) “The effect of amino groups on the stability of DNA
duplexes and triplexes based on purines derived from inosine” Nucleic Acids
Res., 29, 2522-2534.
- Güimil García, R., Brank, A.S., Marquez, V.E.,
Christman J.K., Eritja, R. (2001) “Synthesis of
oligonucleotide inhibitors of DNA (Cytosine-C5) methyltransferase containing
5-azacytosine residues at specific sites.” Antisense Nucleic
Acid Drug Development, 11, 369-378.
- Cubero, E., Aviñó, A., de la Torre, B.G., Frieden,
M., Eritja, R., Luque, F.J., González, C., Orozco, M. (2002) “Hoogsteen-based
parallel-stranded duplexes of DNA. The effect of 8-amino derivatives.” J.
Am. Chem. Soc., 124, 3133-3142.
- Aviñó, A., Frieden, M., Morales, J.C de la Torre,
B.G., Güimil-García, R., Azorín, F., Gelpí, J.L., Orozco, M., González, C.,
Eritja, R. (2002) “Properties of triple helices formed by parallel-stranded
hairpins containing 8-aminopurines.” Nucleic Acids Res., 30,
2609-2619.
- De la Torre, B.G., Morales, J.C., Aviñó, A.,
Iacopino, D., Ongaro, A., Fitzmaurice, D., Murphy, D., Doyle, H., Redmond, G.,
Eritja, R. (2002) “Synthesis of oligonucleotides carrying anchoring groups and
their use in the preparation of oligonucleotide-gold conjugates.” Helv.
Chim. Acta, 85, 2594-2607.
- Williams, K.A., Veenhuizen, P.T.M., de la Torre,
B.G., Eritja, R., Dekker, C. (2002) “Carbon nanotubes with DNA recognition.” Nature, 420,
761.
- De la Torre, B.G., Eritja, R. (2003) “Synthesis of
labelled PNA oligomers by a post-synthetic modification approach.” Biorganic
& Med. Chem. Lett., 13, 391-393.
- Grimau, M.G., Iacopino, D., Aviñó, A., de la Torre,
B.G., Ongaro, A., Fitzmaurice, D., Wessels, J., Eritja, R. (2003) “Synthesis of
branched oligonucleotides as templates for the assembly of nanomaterials.” Helv.
Chim. Acta, 86, 2814-2826.
- Aviñó, A., Cubero, E., González, C., Eritja, R., Orozco, M. (2003)
“Antiparallel triple helices. Structural characteristics and stabilization by
8-amino derivatives.” J. Am. Chem. Soc., 125, 16127-16138.
Grupo
MECANISMOS DE REPLICACIÓN Y MANTENIMIENTO DE
VIRUS RNA EN
Saccharomyces
cerevisiae
Centro Mixto “Instituto de Microbiología Bioquímica”
CSIC/Universidad de Salamanca
Avda. del campo Charro s/n
37007 Salamanca
Teléfono: 923 120673 Fax: 923 224876
Esteban Cañibano, María Rosa, Ciéntifico Titular, mrosa@gugu.usal.es
Tsutomu
Fujimura, Investigador,
Rodríguez Cousiño, María Nieves, Profesora Titular,
Vega Hernández, María Lorena, Becaria Predoctoral,
Líneas de Investigación:
Estamos estudiando los
mecanismos de replicación y mantenimiento de virus con genoma tipo RNA en Saccharomyces cerevisiae. La mayor parte
de las cepas de laboratorio llevan en
su citoplasma RNAs virales; algunos de ellos están encapsidados en partículas
víricas y otros no se encapsidan. El más frecuente dentro del primer grupo es
el virus L-A. El genoma es un RNA bicatenario de 4.6 kb y está encapsidado en
partículas icosaédricas de 40 nm de diámetro. Muchas cepas llevan, además, un
virus satélite de L-A, denominado M1. El genoma de M1 (1.8 kb) codifica para la
producción de la toxina "killer" K1. Nuestro grupo está
trabajando principalmente en el modo de
acción de la RNA polimerasa dependiente de RNA que mantiene estos virus.
Los otros virus objeto de
estudio son dos virus RNA de polaridad positiva pertenecientes a la familia Narnaviridae, denominados "20S
RNA" y "23S RNA". Los genomas son de pequeño tamaño (2.5-3 kb) y
el nombre viene de “Naked RNA
virus” ya que codifican únicamente para una RNA polimerasa dependiente
de RNA y no hay información para proteínas de cápsida. A pesar de no estar
encapsidados, estos RNAs no se encuentran desnudos en el citoplasma de la
levadura, si no que se asocian con sus RNA polimerasas formando complejos
ribonucleoproteicos en los que el RNA y la polimerasa están con una
estequiometría 1:1. A partir de estos complejos parcialmente purificados hemos
puesto a punto un sistema de replicación in vitro para la síntesis de
20S RNA. Con este sistema hemos analizado los intermediarios de la replicación
de este virus y hemos propuesto un modelo de replicación que es similar al de
otros virus RNA de polaridad positiva.
Respecto a 23S RNA, recientemente hemos
puesto a punto un sistema de generación del virus a partir de su cDNA clonado
en un vector de expresión de levaduras.
Este es el primer caso descrito en un virus de levadura. El virus así
generado es estable una vez eliminado el vector y nos permite llevar a cabo
estudios de genética reversa. De esta forma hemos iniciado la caracterización
de las señales en cis existentes en
el extremo 3’ de la cadena (+) importantes en la replicación. En esta zona
hemos determinado la existencia de un señal bipartita formada por una
estructura secundaria en horquilla próxima a dicho extremo, en la cual existen
dos bases no apareada en medio de una zona bicatenaria que son críticas para la
replicación. La otra parte de la señal la constituyen las últimas bases del
extremo 3’. Además hemos detectado la existencia de un sistema de reparación de
dichos extremos in vivo, ya que si se modifican o eliminan las dos
últimas bases en el vector, el virus generado es capaz de repararlas in vivo.
Estamos interesados en estos mecanismos de reparación, ya que estos virus de
levadura infectan de forma persistente la célula y creemos que este mecanismo
puede facilitar el mantenimiento de dichos extremos intactos durante largos
periodos de tiempo.
En resumen, consideramos
los virus RNA de S. cerevisiae como
sistemas modelo para el estudio de los mecanismos de replicación viral y las
interrelaciones virus RNA/hospedador, dada la simplicidad de su organización
genómica y la facilidad de manipulación del hospedador. Los conocimientos
adquiridos se podrán extrapolar a otros virus RNA que infectan células eucarióticas
superiores en las cuales es más difícil abordar un tipo de estudios semejante.
Uno de los aspectos más interesantes es el modo de acción de las RNA
polimerasas dependientes de RNA (enzimas exclusivamente de origen viral).
Además los complejos ribonucleoproteicos en que se encuentran 20S RNA y 23S RNA
constituyen un sistema adecuado para el estudio de las interrelaciones
RNA/proteína. Si se conocen en detalle el modo de replicación de estos virus
así como los procesos metabólicos de la célula que puedan estar afectados por
su presencia será posible diseñar drogas que interfieran específicamente en
algunos de estos procesos, sin dañar al hospedador.
Publicaciones relevantes
(1999-2003):
- SOLORZANO,A.,RODRIGUEZ-COUSIÑO,N.,ESTEBAN,R.,FUJIMURA,T. (2000)
Persistent
yeast single-stranded RNA viruses exist in vivo as genomic RNA.RNA
polymerase complexes in 1.1 stoichiometry J.Biol.Chem. 275:
26428-26435
-
FUJIMURA,T.,ESTEBAN,R. (2000). Recognition of RNA encapsidation signal by the yeast L-A double-stranded
RNA virus J.Biol.Chem. 275: 37118-37126
- ESTEBAN,R., FUJIMURA,T. (2003) Launching the Yeast 23S RNA
Narnavirus Shows 5’ and 3’ cis-acting
Signals for Replication. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100: 2568-2573
- FUJIMURA, T, ESTEBAN, R. Bipartite 3’ cis-acting signal for Replication in
Yeast 23S RNA virus and its Repair. J.Biol.Chem. (enviado).
Responsable: Ricardo Flores Pedauyé
Instituto de
Biología Molecular y Celular de Plantas (UPV-CSIC)
Campus Universidad
Politécnica de Valencia
Avenida de los Naranjos
s/n
46022 Valencia.
Teléfono: 96
3877861 Fax: 96 3877859
http:// www.ibmcp.upv.es
Ricardo Flores
Pedauyé, Profesor
de Investigación,
José-Antonio Darós
Arnau, Científico Titular,
Ángel-Emilio
Martínez de Alba, Postdoctoral,
Sonia Delgado
Villar, Postdoctoral,
Selma Delgado
Zachert Postdoctoral,
María-Eugenia Gas
López, Becaria Predoctoral,
Alberto Carbonell
Olivares, Becaria Predoctoral,
Diego Molina
Serrano, Becaria Predoctoral,
Amparo Ahuir Roca,
Ayudante de Investigación,
Líneas de Investigación:
El trabajo del grupo está dirigido esencialmente al
estudio de los viroides, pequeños RNAs subvirales de plantas con un gran
interés desde una perspectiva básica, pues son el peldaño más bajo de toda la
escala biológica, como desde un punto de vista aplicado ya que inducen
importantes enfermedades. En particular, estudiamos su estructura molecular,
mecanismos de replicación (enzimas y particularmente ribozimas implicados),
mecanismos de patogénesis y origen evolutivo.
Publicaciones relevantes (1999-2003)
- DE
LA PEÑA, M. NAVARRO, B., & FLORES, R. (1999). Mapping the
molecular determinant of pathogenicity in a hammerhead viroid: a tetraloop
within the in vivo branched RNA
conformation. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the USA 96: 9960-9965.
-
FLORES, R., DARÒS, J.A. & HERNÁNDEZ, C. (2000). The Avsunviroidae family: viroids containing
hammerhead ribozymes. Advances in
Virus Research 55: 271-323.
-
NAVARRO, J.A. & FLORES, R. (2000). Characterization of
the initiation sites of both polarity strands of a viroid RNA reveals a motif
conserved in sequence and structure. The
EMBO Journal 19: 2662-2670.
- FLORES, R.,
DARÒS, J.A., HERNÁNDEZ, C. & DI SERIO, F. (2001). Viroids. In Nature Encyclopedia of Life Sciences
(Robertson, S., Ed.), pp. 1-9. Macmillan Reference Limited (Nature Publishing
Group), London, U.K., www.els.net.
- DE LA PEÑA, M.
& FLORES, R. (2001). An extra nucleotide in the consensus catalytic core of
a viroid hammerhead ribozyme: implications for the design of more efficient
ribozymes. Journal of Biological
Chemistry 276: 34586-34593.
- DARÒS, J.A.
& FLORES, R. (2002). A chloroplast protein binds a viroid RNA in vivo and facilitates its
hammerhead-mediated self-cleavage. The
EMBO Journal 21: 749-759.
- DE LA PEÑA, M.
& FLORES, R. (2002). Chrysanthemum chlorotic mottle viroid RNA: dissection
of the pathogenicity determinant and comparative fitness of symptomatic and
non-symptomatic variants. Journal of
Molecular Biology 321: 411-421.
- MALFITANO, M.,
DI SERIO, F., COVELLI, L., RAGOZZINO, A., HERNÁNDEZ C. & FLORES, R. (2003).
Peach latent mosaic viroid variants inducing peach calico contain a
characteristic insertion that is responsible for this symptomatology. Virology 313: 492-501.
- DE LA PEÑA, M.,
GAGO, S. & FLORES, R. (2003). Peripheral regions of natural hammerhead
ribozymes greatly increase their self-cleavage activity. The EMBO Journal 22: 5561-5570.
Responsable:
Puri Fortes
Laboratorio de
vectores. Fima.
Edificio Los
Castaños. Universidad de Navarra
Irunlarrea 1.
31008 PAMPLONA.
Teléfono:
948-425600 Ext 6515 Fax:
948-425700
Puri Fortes, Investigadora,
pfortes@unav.es
Maria Vera Ugalde, Becaria
predoctoral, mveruga@alumni.unav.es
Iñigo Narvaiza, Becario
predoctoral, inarcue@unav.es
Nerea Razquin, Técnico
de Laboratorio, nrazquin@unav.es
Líneas de
Investigación:
La inhibición específica de la expresión génica se puede utilizar para
averiguar la función de genes desconocidos o bloquear la expresión de genes tóxicos
para la célula, como genes virales u oncogenes. Ambas posibilidades resultan de
enorme interés hoy en día.
1. SILENCIAMIENTO GENICO BASADO EN U1 snRNAs
En el laboratorio hemos desarrollado una técnica de inhibición de la
expresión basada en snRNAs U1 modificados. Si expresamos en la célula moléculas
de U1 snRNA cuyo extremo 5' se ha modificado para que reconozca secuencias
cercanas a zonas de poliadenilación en un mensajero concreto, se inhibe
específicamente la poliadenilación de ese mensajero.
El sistema sirve para inhibir la expresión génica tanto de forma
transitoria como estable. Hemos estudiado las características de este sistema
de inhibición. La distancia entre la zona de interacción de la snRNP U1 y las
secuencias de poliadenilación parece irrelevante, de modo que se observa
inhibición incluso cuando esta distancia es mayor de 1000 nucleótidos. La
eficiencia de la inhibición aumenta cooperativamente cuando a un mismo RNA
diana se le unen varias moléculas de la snRNP U1, de modo que con un máximo de
tres moléculas se ha conseguido inhibir la expresión hasta 1000 veces. Si las
secuencias diana forman estructuras secundarias, se impide la inhibición,
probablemente porque el snRNA U1 no puede interaccionar con ellas. Aumentar la
longitud del extremo 5´ que interacciona con el RNA diana no mejora la
inhibición, probablemente porque los U1s resultantes son poco estables. De
hecho la mejor inhibición se obtiene cuando 10 nucleótidos del U1 interaccionan
con el RNA diana y para que el sistema funcione hace falta un mínimo de 8
nucleótidos.
FUTURO
Existen posibilidades de mejorar esta técnica inhibitoria. Queremos
averiguar y aumentar su especificidad y desarrollar métodos que permitan
seleccionar las secuencias diana más accesibles a su efecto. Como ejemplo,
estudiaremos las secuencias de los mRNAs del virus de la Hepatitis B (HBV). Los
snRNAs U1 modificados que interaccionen eficientemente con estas secuencias,
bloquearán la expresión de HBV y por ello, serían candidatos a ser utilizados
en protocolos de terapia génica y regeneración de hígados infectados. Se
pretende ensayar esta técnica en modelos animales, incluso, utilizando
promotores inducibles o específicos de hígado. Por último, queremos aplicar
esta tecnología para averiguar función génica utilizando una librería de genes
que codifican para snRNAs U1 modificados.
2. SILENCIAMIENTO GENICO BASADO EN RNAi
Recientemente se ha descrito la interferencia de RNA (RNAi) como método
de inhibir la expresión génica. El mediador de esta inhibición es una molécula
pequeña de RNA (siRNA). Nosotros hemos expresado estas moléculas de RNA
pequeños a partir de vectores adenovirales y hemos conseguido inhibir la
expresión genica en hígado de ratón.
FUTURO
Queremos utilizar este sistema para estudiar
la inhibición por interferencia de RNA “in vivo”. También planeamos estudiar la
relación entre la interferencia de RNA y la infección viral en células de
mamífero y posibles alteraciones de la interferencia de RNA en distintas
enfermedades.
NIH. Expression of human therapeutic proteins in transgenic tobacco
chloroplasts.
1/05/2002-30/04/2006
Investigador responsable: Henry Daniells y Jesús Prieto
Entidades Participantes: Universidad de Florida, FIMA, Universidad
pública de Navarra
SAF2003-01804.
MCyT. Desarrollo y análisis
de la inhibición específica de la expresión génica basada en snRNAs U1
modificados.
Diciembre 2003/
Diciembre 2006
Investigador responsable: Puri Fortes
Entidades participantes: Universidad de Navarra, universidad de Leiden
Gobierno
de Navarra. Desarrollo de
vectores basados en SV40: Biodistribución y aplicaciones en el tratamiento de
la cirrosis hepática.
Enero 2004/ Diciembre 2005
Investigador responsable: Puri Fortes
Publicaciones (1999-2003:
- M. A. Klieber, I. Hernraj, P.
Verkade, M. Kohrmann, P. Fortes, R.
M. Marión, J. Ortín y C. G. Dotti. The mammalian staufen protein localizes to the somatodendritic domain of
cultured hippocampal neurons: implications for its involvement in mRNA
transport. J. Neuroscience. 19: 288-297. 1999.
- K. F. Wilson, P. Fortes, U. S. Singh, M. Ohno, I. W. Mattaj y R. A. Cerione. The nuclear cap binding complex is a novel target of growth factor receptor-coupled signal transduction. J. Biological Chemistry. 274: 4166-4173. 1999.
- P. Fortes, R. M. Marión, A. Beloso, C. Dotti y J. Ortín. A human sequence homologue of Staufen is an RNA-binding protein that is associated with polysomes and localizes to the rough endoplasmic reticulum. Molecular and Cellular Biology. 19: 2212-2219. 1999.
- P. Fortes, A. M. Falcón, A. Beloso y J. Ortín. Interaction of influenza virus NS1 protein and the human homologue of staufen in vivo and in vitro. Nucleic Acids Research. 27: 2241-2247. 1999.
- P.
Fortes, J. Kufel, M. Fornerod, M. Polycarpou-Schwarz, D. Lafontaine, D.
Tollervey y I. W. Mattaj. Genetic and physical interactions involving the yeast
nuclear cap-binding complex. Molecular and Cellular Biology. 19: 6543-6553.
1999.
- P. Fortes, D. Bilbao-Cortés, M. Fornerod, G. Rigaut, W. Raymond, B. Séraphin y I. W. Mattaj. Luc7p, a novel yeast U1 snRNP protein with a role in 5' splice site recognition. Genes and Development. 13: 2425-2438. 1999.
- P. Fortes, T. Inada, T. Preiss, M. Hentze, , I. W. Mattaj y A. Sachs. The nuclear cap binding complex interacts with the translation initiation machinery and promotes translation in the absence of eIF4E. Molecular Cell. 6: 191-196. 2000.
- M. G. Kramer, M. A. Barajas, N. Razquin, P. Berraondo, M. Rodrigo, C. Wu, C. Qian, J. Prieto y P. Fortes. In vitro and in vivo comparative study of chimeric liver specific promoters. Molecular Therapy. 7: 375-385. 2003.
- M. L. Martínez–Chantar, E. R. García–Trevijano, M. U. Latasa, A. Martín–Duce, P. Fortes, J. Caballería, M. A. Avila y J. M. Mato. Methionine Adenosyltransferase II b Subunit Gene Expression Provides a Proliferative Advantage in Human Hepatoma. Gastroenterology 124: 940-948. 2003.
- J. Baron-Benhamou, P. Fortes T. Inada, T. Preiss y M. W. Hentze. The interaction of the cap-binding complex (CBC) with eIF4G is dispensable for translation in yeast. RNA 9: 654-662. 2003.
- P. Fortes, Y. Cuevas, F. Guan, P. Liu, S. Pentlicky, S. Jung, M. L. Martínez-Chantar, J. Prieto, D. Rowe y S. I. Gunderson..Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5´end-mutated U1 snRNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. PNAS 100: 8264-8269. 2003.
- I. Tirapu, M. P. Colombo, M.
Zaratiegui, A. Arina , P. Berraondo, P. Fortes, J. Prieto, L. Chen y I. Melero. Endogenous expression of B7-1 (CD80) below the threshold for activation
is a new escape mechanism of colon carcinoma. Enviado J.
Exp. Med.
- M. Vera, D. Strayer, J. Prieto y P. Fortes. Factors influencing the production of recombinant SV40 vectors. Mol. Therapy. Enviado.
- M. Vera y P. Fortes. Simian virus 40
as a gene therapy vector. DNA and Cell Biology. Enviado.
- H. J. McKee, P. Y. T’sao, M. Vera, P. Fortes y D. S. Strayer. Durable Cytotoxic Immune Responses Against gp120 Elicited by Recombinant SV40 Vectors Encoding HIV-1 gp120 ± IL-15. Enviado.
Grupo “Regulation of protein synthesis in
eukaryotes”
Centre de Regulació Genómica
Gene Regulation Programme
Passeig Marítim 37-49
08003-Barcelona
Teléfono: 93-2240920 Fax: 93-2240899
Componentes del
Grupo
Fátima Gebauer, Jefa de Grupo, fatima.gebauer@crg.es
Rafael Cuesta, Postdoctoral, rafael.cuesta@crg.es
Irina Abaza, Becaria Predoctoral, irina.abaza@crg.es
Solenn Patalano, Becaria Predoctoral, solenn.patalano@crg.es
Olga Coll, Técnico de laboratorio, olga.coll@crg.es
We are
interested in the regulation of mRNA translation by RNA-binding proteins and by
elongation of the mRNA poly(A) tail (i.e. cytoplasmic polyadenylation). In the
lab, these mechanisms of translational control are studied under three
different biological contexts: X-chromosome dosage compensation, early
embryonic patterning and cell cycle progression.
Dosage
compensation in Drosophila is achieved
by hypertranscription of the male X chromosome via the action of a
ribonucleoprotein complex known as the MSL (for male specific lethal). This process is inhibited in female flies
primarily because the expression of one of the MSL components, the protein
MSL-2, is repressed. Sex-lethal (SXL),
a female-specific RNA-binding protein, binds to stretches of uridines present
in the 5’ and 3’ UTRs of msl-2 pre-mRNA,
which ultimately results in inhibition of msl-2
mRNA translation. Translational repression requires additional factors that are
nucleated by SXL in the 3´UTR of msl-2. Current research focuses on isolating
and identifying the putative co-repressors as well as assessing their role in
SXL-mediated translational regulation and development.
The
establishment of the early antero-posterior and dorso-ventral axes in
Drosophila is achieved by a series of translational control events affecting
key patterning regulators. Two of these are the homeodomain protein Bicoid and
the transmembrane receptor Toll.
Expression of both Bicoid and Toll is activated at specific times in
development by cytoplasmic polyadenylation of their respective maternal mRNAs.
In order to study the translational regulation of Bicoid and Toll mRNAs, we
have set up a cell-free system that recapitulates both cytoplasmic
polyadenylation and translation of these transcripts. We are currently using
this system to identify the cis-acting regulatory sequences responsible for
translational control.
Regulation of p27kip mRNA translation
p27kip is
a cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitor that blocks the mammalian cell cycle
in G1 by binding to cyclin E/cdk2.
Proper modulation of p27kip levels is essential for cell
proliferation. One of the mechanisms that modulate the level of p27kip
is the translational regulation of its mRNA.
Translation of p27kip mRNA is driven by an internal ribosome
entry site (IRES) whose activity changes during the cell cycle. Our aim is to identify factors that
specifically regulate p27kip mRNA translation and that could be used
as therapeutic targets in oncology.
Publications
(1999-2003):
-
Grskovic, M., Hentze, M. W. and Gebauer, F. 2003. A co-repressor assembly
nucleated by Sex-lethal in the 3´UTR mediates translational control of
Drosophila msl-2 mRNA. EMBO J. 22:
5571-5581.
- Gebauer,
F., Grskovic, M. and Hentze.M. W. 2003.
Drosophila sex-lethal inhibits the
stable association of the 40S ribosomal subunit with msl-2 mRNA. Mol. Cell, 11:
1397- 1404.
- Bergamini, G. and
Gebauer, F. 2002. Poly(A)-dependent cell-free
translation
systems from
animal cells. In: Cell-free translation systems. Alexander S. Spirin (Ed.)
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp.79-88.
- Gebauer, F., Ostareck, D.,
Ostareck-Lederer, A., Grskovic, M. and Hentze, M. W. 2001. Translational
control via the 3’ UTR: single regulators and/or co-repressor assemblies?. In:
Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology: The Ribosome. vol. 66,
pp.329-336.
-
Gebauer, F. and Hentze, M. W. 2001. Fertility facts: male and female germ cell
development requires translational control by CPEB. Mol. Cell 8: 247-249.
-
Castagnetti, S., Hentze, M. W., Ephrussi, A. and Gebauer, F. 2000. Control of
oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila
ovaries. Development. 127: 1063-1068.
- Gebauer, F.,
Corona, D. F. V., Preiss, T., Becker, P. B. and Hentze, M. W. 1999.
Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal:
cooperative silencing via the 5’ and 3’ UTRs of msl-2 mRNA is independent of
the poly(A) tail. EMBO J. 18: 6146-6154.
Laboratorio de
Hepatología y Medicina Interna
Area B de
Investigación
Hospital Vall
d´Hebron
Paseo del Valle de
Hebrón s/n.
08035 Barcelona
Teléfono: 93
4894034 y 93 4894028 Fax: 93
4894032
Jordi Gómez, Adjunto
de Investigación, jgomez@vhebron.net
Maria Piron, Postdoctoral,
mpiron@vhebron.net
Isabel Leal, Postdoctoral
Nerea
Beguiristain, Becaria Predoctoral,
nbeguiri@vhebron.net
Líneas de trabajo:
Estructura y variabilidad del virus de
la hepatitis c (HCV), peste porcina clásica (PPC), y diarrea bovina viral
(BVDV) . Diseño de ribozimas derivados del RNA catalítico de la RNasa P.
Pretendemos
ampliar el trabajo de “targeting”
antiviral que hemos venido realizando los últimos años contra el RNA del virus
de la hepatitis C a los pestivirus animales relacionados PPC y BVDV. El
ribozima elegido en nuestro caso es el derivado de la RNA catalítico de la
RNasa P. No obstante planteamos el
problema del desarrollo del ribozima
terapéutico sin disociarlo del problema de conocer el ARN diana en relación a:
su estructura, las funciones que asegura, los módulos de expresión o de control
donde se integra, y de su grado de conservación. En concreto estos aspectos se
van a tratar en relación a dos señales del RNA viral recientemente
caracterizadas en el HCV que lo hacen sensible a la RNasa P y a la RNasa III,
en la región de inicio de la traducción del RNA viral.
Técnicas:
Técnicas
bioquímicas y enzimáticas para la caracterización de estructuras en el RNA y
cuantificación del RNA viral (PCR tiempo real) y secuenciación.
Grupo
de Estructura de Acidos Nucleicos en Disolución
Responsable: Carlos González Ibáñez
Instituto de Química Física
“Rocasolano”, CSIC
C/ Serrano 119
28006 Madrid.
Teléfono: 91 5619400-ext 1166 Fax: 91 5642431
Componentes del Grupo
Carlos González Ibáñez, Científico
Titular, cgonzalez@iqfr.csic.es
Irene Gómez Pinto, Postdoctoral
Jaime Lopez de la Osa, Becario predoctoral.
Líneas de Investigación:
El tema general de
investigación de nuestro grupo es la determinación de estructuras de ácidos
nucleicos en disolución, tanto aislados, como en complejos con proteínas y
otros ligandos. El objetivo fundamental que nos planteamos es el de contribuir
a la comprensión de los fenómenos de reconocimiento molecular en los que
intervienen ácidos nucleicos. La técnica que empleamos para ello es
fundamentalmente la Resonancia Magnética Nuclear.
Dentro del campo de los ácidos nucleicos hemos puesto
especial atención al estudio de estructuras no-canónicas del DNA, así como en
deformaciones inducidas en estructuras de doble cadena. Gran parte de nuestro
trabajo de investigación lo llevamos a cabo mediante colaboraciones que
mantenemos con grupos especializados en temas relacionados. Entre estos grupos
hay que destacar grupos teóricos como los del Prof. Modesto Orozco (Univ. de
Barcelona) y el Prof. Federico Gago (Univ. de Alcalá de Henares) y grupos
expertos en síntesis de oligonucleótidos, como los del Prof. Enrique Pedroso
(Univ. de Barcelona) y el Prof. Ramón Eritja (CSIC, Barcelona). Recientemente
también hemos comenzado una colaboración con el grupo de cristalografía del
Prof. Subirana (Univ. Politécnica de Barcelona).
Dentro del campo general de estructuras de ácidos
nucleicos, los temas concretos en los que hemos trabajado recientemente son:
1.- Estudios de estructuras tetracatenarias (o
cuadruplexes) del ADN. Estas estructuras son importantes en diversos procesos
biológicos, como son la formación de telómeros, inestabilidad genética por la
expansión de los llamados “triplet repeats”, etc. En general estas estructuras
están formadas por tétradas de guaninas. Nosotros hemos observado otro tipo de
tétradas formadas por asociación de dos pares tipo Watson-Crick a través de su
surco menor. Esta asociación da lugar a una estructura tetracatenaria
topologicamente diferente a los cuádruples de guaninas clásicos.
2.- Otro motivo estructural de interés son las horquillas
de ADN. Los estudios de horquillas de ADN se han enfocado en aquellas más
estables. Sin embargo, nosotros hemos utilizado análogos cíclicos para estudiar
giros de ADN menos estables, que no son fácilmente observables en
oligonucleótidos lineales. Algunas de estas estructuras compuestas por dos
horquillas de ADN (llamadas “dumbbells”) son particularmente interesante puesto
que están estabilizadas por pares AT tipo Hoogsteen en lugar de los habituales,
tipo Watson-Crick.
3.- Una de las formas no-canónicas que más han
atraído la atención de la comunidad científica son la hélices triples (o
“tríplex”) de ADN. Estas estructuras tienen interés farmacéutico puesto que
la formación de la hélice triple en una región concreta del genoma puede
impedir la transcripción de la proteína codificada en esa región. La formación
de la triple hélice es muy selectiva por lo que esta estrategia permitiría, en
principio, diseñar fármacos que bloqueasen la expresión de un único gen. Uno de
los problemas que se plantean es el estabilizar la formación del tríplex
mediante las adecuadas modificaciones químicas. Entre las muchas modificaciones
propuestas, se ha observado que la sustitución del protón en posición 8 de la
hebra de polipurinas por un grupo –NH2 estabiliza enormemente la
formación del tríplex. En colaboración con los grupos del Prof. Modesto Orozco
y el Prof. Ramón Eritja, hemos llevado a cabo un análisis estructural del
efecto de esta substitución en diversas hélices triples y horquillas de ADN.
4.- Además del estudio de formas no-canónicas,
también estamos interesados en el estudio de deformaciones que se producen en
fragmentos de doble hélice. Estas variaciones conformacionales en la doble
hélice del ADN (curvatura, desenrollamiento, etc.) tienen importancia en
procesos de reconocimiento por proteínas u otros ligandos. A. Estos efectos son
generalmente sutiles y resulta difícil observarlos mediante RMN. No obstante
hemos hecho esfuerzos en determinar la estructura de oligonucleótidos
modificados en los que la modificación induce una curvatura moderada por efecto
de la anulación parcial de las cargas de los fosfatos o por efecto de un
“cross-link” entre los extremos del dúplex. Otras modificaciones
inducen distorsiones más drásticas en la estructura del ADN, como son un
desenrollamiento parcial de la doble hélice. Algunas de estas modificaciones
tienen un interés adicional porque los oligonucleótidos que las contienen son
sustratos de enzimas de reparación del ADN celular. Los procesos de reparación
se conocen sólo parcialmente, pero se sabe que el fallo de tales mecanismos es
imprescindible para el desarrollo del cáncer. Algunos sistemas de reparación,
como el de excisión-reparación, son capaces de reconocer una gran número de
modificaciones químicas (o “lesiones”) en el ADN. El estudio de estas
“lesiones” puede darnos un conocimiento muy útil para entender el modo de
acción de estos enzimas.
5.- Finalmente, también estamos investigando
diferentes facetas del proceso reconocimiento molecular entre ácidos
nucleicos y proteínas y otros pequeños ligandos. En el campo de
interacciones proteína-DNA, hemos determinado la estructura de varias proteínas
que reconocen ácidos nucleicos9 y esperamos obtener pronto algunos
complejos. También estamos interesados en estudiar interacciones concretas
entre proteínas y DNA, como son las interacciones de apilamiento entre
nucleobases y residuos aromáticos. Para ello hemos usado derivados en los que
el péptido y el ADN están unidos covalentemente. Esta unión covalente permite
analizar estas interacciones con un alto grado de precisión, no solo en el
ámbito estructural, sino también cuantificar diversos parámetros
termodinámicos. También estamos llevando a cabo diversas colaboraciones con
grupos de Química Orgánica en el estudio de interacciones entre ácidos
nucleicos y pequeños ligandos.
EQUIPAMIENTO:
Contamos con un espectrómetro de AV-800US2, recientemente instalado,
y otro AV-600 equipado con criosonda, además de instrumentación adicional
consistente en un espectropolarímetro de CD, facilidades de cálculo intensivo,
y un laboratorio de expresión y purificación de proteínas plenamente equipado.
Publicaciones
(1999-2003):
- N. Escaja, E. Pedroso, M. Rico and C.
González. "Dimeric Solution Structure of Two Cyclic Octamers. Four-Stranded
DNA Structures Stabilized by A:T:A:T and G:C:G:C Tetrads”. J. Am. Chem. Soc., 122, 12732-12742, 2000.
- R. Soliva,
R. Güimil-García, J. Ramón Blás, R. Eritja, J.L. Asensio, C. González, F.J.
Luque and M. Orozco. "DNA-triplex
stabilizing properties of 8-aminoguanine". Nucleic Acids Research, 28, 4531-4539, 2000.
- R.Soliva, V.Monaco, I.
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- E. Cubero,
A. Aviñó, B. García de la Torre, M. Frieden, R. Eritja, F.J. Luque, C. González
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parallel-stranded duplexes of DNA. The effect of 8-amino derivatives". J. Am. Chem. Soc., 124, 3133-3142,
2002.
- A. Aviñó,
M. Frieden, J. C. Morales, B. García de la Torre, R. Güimil-García, F. Azorín,
J.L. Gelpí, M. Orozco, C. González and R. Eritja. "Properties of triple-helices formed by parallel-stranded hairpins
containing 8-aminopurines". Nucleic
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- I.
Gómez Pinto, V. Marchán, F. Gago, A. Grandas and C. González. "Solution
structure and stability of tryptophan-containing nucleopeptide duplexes". ChemBioChem,
4, 40-49, 2003.
- N. Escaja, I. Gómez-Pinto, M. Rico, E. Pedroso, and C. González
"Structure and stability of small DNA dumbbells with Watson-Crick and
Hoogsteen base pairs". ChemBioChem, 4, 623-632, 2003.
- N. Escaja, J.L. Gelpí, M. Orozco, M. Rico, E. Pedroso, and C. González
"A four stranded DNA structure stabilized by a novel G:C:A:T tetrad".
J. Am. Chem. Soc., 125, 5654-5662,
2003.
- A.
Aviñó, E. Cubero, C. González, F.J. Luque, R. Eritja and M. Orozco. "Antiparallel
triple helices: structural characteristics and stabilization by 8-amino
derivatives". J. Am. Chem. Soc.,
125, 16127-16138, 2003.
- I. Gómez Pinto, V. Marchán, F. Gago, A. Grandas and C.
González. "Solution
structure and stability of a disulfide cross-linked nucleopeptide duplex".
Chem
Commun (Camb), 20, 2558-2559, 2003.
Grupo INICIACIÓN INTERNA DE LA TRADUCCIÓN DIRIGIDA
POR IRES
Responsable: Encarnación Martínez Salas
Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa",
CSIC-UAM
Cantoblanco, 28049 Madrid,
Teléfono: 91 4975533 / 91 4978472 Fax:
91 4974799
http://www2.cbm.uam.es/cbm2001/
Encarnación Martínez Salas, Investigador
Científico, emartinez@cbm.uam.es
Sandrine Reigadas, Postdoctoral,
Olga Fernández Miragall, Becaria Predoctoral,
Almudena Pacheco, Becaria Predoctoral,
Paula Serrano, Becaria Predoctoral,
Jorge
Ramajo, Técnico laboratorio,
Líneas de investigación:
A.- Bases
moleculares de la iniciación interna de la traducción en RNAs mensajeros
eucarióticos.
La iniciación
interna facilita la traducción de RNAs mensajeros eucarióticos específicos aún
en condiciones de estrés celular o en etapas de inactividad nuclear, en las que
la iniciación dependiente de cap está fuertemente inhibida. Estos RNAs se
caracterizan por disponer de una región 5´ no traducida larga y fuertemente
estructurada en la que se localiza un elemento que actúa en cis, denominado
sitio de entrada interna del ribosoma
(IRES). El objetivo final de nuestro grupo es entender como desempeñan
la misma función elementos IRES que tienen secuencias diferentes, sin aparente
conservación de su estructura. Para conseguir este objetivo utilizamos como
modelo IRES de picornavirus y flavivirus (FMDV y HCV) y esperamos extender el
estudio a IRES de mRNAs celulares. Nos interesa conocer la estructura
secundaria y terciaria del IRES, teniendo en cuenta la posibilidad de que existan
interacciones directas con el ribosoma. En paralelo, estamos estudiando la
implicación de factores transactivadores, tanto factores de iniciación de la
traducción como otras proteínas auxiliares que puedan modular la estructura del
RNA y/o su capacidad de interaccionar con el ribosoma, explicando el tropismo
de algunos IRES. Además nos interesa
conocer el efecto de la modificación de factores transactivadores en respuesta
al estrés, así como factores involucrados en la recircularización del RNA a través
de interacciones de los extremos 3´ y 5´ del mRNA.
B.- Análisis de la
relación entre estructura y función del IRES.
El entendimiento de la relación
entre estructura y función es clave para poder diseñar estrategias específicas
tendentes a inactivar estos elementos. Los IRES de picornavirus figuran entre
los mejor caracterizados a nivel molecular. Cada IRES se subdivide en dominios
estructurales cuya función, ya sea la interacción con factores proteicos o la
organización espacial del IRES, guarda una estrecha relación con la estructura
que poseen. A día de hoy, hay grandes lagunas en el papel que desempeña el
dominio central, denominado 3 o I. Por un lado, parece ser un lugar de
conexiones terciarias dentro del IRES, y por otro podría ser responsable de
interacciones RNA-ribosoma. Hay 2 objetivos concretos en esta línea de trabajo:
1. Reconstitución de complejos de iniciación de la traducción in vitro y
determinación de los resíduos del dominio central protegidos en estos
complejos. Identificación de los componentes que producen el patrón de
protección correspondiente en FMDV y EMCV. 2. Caracterización molecular del
proceso de identificación del segundo AUG viral en el IRES de FMDV. Mientras
que nuestro grupo ha publicado resultados que favorecen la entrada directa
hasta el segundo AUG, otros grupos han sugerido el rastreo del ribosoma desde
el sitio de contacto en el IRES hasta el AUG funcional, que abarca unos 100 nt,
incluidos los 84 resíduos que separan los 2 codones de inicio de la traducción en FMDV. En este
objetivo se pretende averiguar la influencia de eIF1A en la formación de
complejos 48S activos sobre el segundo AUG funcional de FMDV, el más usado
además de ser el único que no se puede eliminar sin alterar la viabilidad del
RNA viral.
C.- Vectores de
expresión policistrónicos bioseguros para células animales
El desarrollo de organismos modificados genéticamente conlleva la expresión
de varios genes, siendo al menos uno de ellos un gen seleccionable, un gen
suicida o un marcador de expresión. Los IRES constituyen una herramienta básica
para diseñar vectores policistrónicos, en los que a partir de una única unidad
de transcripción se sinteticen dos o más proteínas de forma simultánea. Este
tipo de vectores son bioseguros aunque provengan de agentes infecciosos, dado
que los IRES son fragmentos del mRNA que funcionan fuera de su contexto
genético, y se pueden integrar en el cromosoma de las células de interés de
forma que son útiles tanto en expresión transitoria como constitutiva. La
actividad IRES es resistente a condiciones de estrés celular que conllevan la
inhibición de la traducción dependiente de cap, facilitando la traducción del
cistrón que les sigue aún en situaciones de estrés severas. Por otro lado, los
IRES provenientes de distintos mRNAs interaccionan con proteínas específicas,
lo que proporciona propiedades de tropismo celular en función de que las
células dispongan de las proteínas transactivadoras específicas. Los objetivos
concretos de esta línea de trabajo son: 1. Construcción de vectores
policistrónicos por combinación de IRES virales y celulares. 2.
Competición entre distintos IRES localizados en RNAs policistrónicos:
interacción con proteínas específicas. Esperamos que la combinación de
los resultados obtenidos nos proporcione una visión panorámica de la dinámica
de complejos ribonucleoproteicos implicados en la actividad IRES.
Proyectos en
vigor:
BMC2002-00983,
McyT. Bases moleculares de la iniciación interna de la traducción en RNAs
mensajeros eucarióticos. Diciembre 2002 - diciembre 2005
Investigador principal: E. Martínez-Salas
INTAS 01-0293, UE.
The structure and function of the internal ribosome entry site from
foot-and-mouth disease and encephalomyocarditis virus RNAs. Mayo 2002 – mayo
2004
Investigador
principal: E. Martínez-Salas, en colaboración con I. Shatsky, G. Belsham
(coordinador), G. Karpova.
07B/0052/2002,
CAM. Vectores de expresión policistrónicos bioseguros para células animales
Enero 2003 - diciembre 2004
Investigador principal: E. Martínez-Salas
Publicaciones (1999-2003)
- Martínez-Salas, E. "Internal ribosome
entry site (IRES) biology and its use in gene expression vectors".
Curr. Opin. Biotechnol. 10, 458-464 (1999).
- Ramos, R. and Martínez-Salas, E.
"Long-range interactions in aphthovirus internal ribosome entry site
elements". RNA 5, 1374-1383 (1999)
- López de Quinto, S., and Martínez-Salas, E.
"Involvement of the aphthovirus RNA sequence located between both
functional AUGs in start codon selection". Virology 255, 324-336
(1999).
- Ibarrola, N.,
Moreno-Monteagudo, J.A., Sáiz, M., García-Monzón, C., Sobrino, F., García-Buey,
L., Lo Iacono O., Moreno-Otero, R., and Martínez-Salas, E. Response to
retreatment with interferon-alpha plus ribavirin in chronic hepatitis C
patients is independent of the NS5A gene nucleotide sequence. Am. J.
Gastroenterol. 94, 2487-2495 (1999).
- Bigeriego, P., Rosas, M.F., Zamora, E., Martínez-Salas,
E., and Sobrino, F. "Heterotypic inhibition of foot-and-mouth disease
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3´ regions" Antiviral Res. 44, 133-141 (1999).
- Sáiz, J-C., López de Quinto, S., Ibarrola, N.,
López-Labrador, F-X., Sánchez-Tapias, J-M., Rodés, J., and Martínez-Salas, E. "Internal
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- Schneider R, Agol VI, Andino R, Bayard F, Cavener
DR, Chappell SA, Chen JJ, Darlix JL, Dasgupta A, Donze O, Duncan R, Elroy-Stein
O, Farabaugh PJ, Filipowicz W, Gale M Jr, Gehrke L, Goldman E, Groner Y,
Harford JB, Hatzglou M, He B, Hellen CU, Hentze MW, Hershey J, Hershey P, Hohn
T, Holcik M, Hunter CP, Igarashi K, Jackson R, Jagus R, Jefferson LS, Joshi B,
Kaempfer R, Katze M, Kaufman RJ, Kiledjian M, Kimball SR, Kimchi A, Kirkegaard
K, Koromilas AE, Krug RM, Kruys V, Lamphear BJ, Lemon S, Lloyd RE, Maquat LE, Martínez-Salas
E, Mathews MB, Mauro VP, Miyamoto S, Mohr I, Morris DR, Moss EG, Nakashima
N, Palmenberg A, Parkin NT, Pe'ery T, Pelletier J, Peltz S, Pestova TV,
Pilipenko EV, Prats AC, Racaniello V, Read GS, Rhoads RE, Richter JD,
Rivera-Pomar R, Rouault T, Sachs A, Sarnow P, Scheper GC, Schiff L, Schoenberg
DR, Semler BL, Siddiqui A, Skern T, Sonenberg N, Tahara SM, Thomas AA, Toulme
JJ, Wilusz J, Wimmer E, Witherell G, Wormington M. "New ways of initiating
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- López de Quinto, S., Sáiz, M.; de la Morena, D., Sobrino,
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- Rosas, M.F., Martínez-Salas, E., and Sobrino,
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- Hernández-Sánchez, C., Mansilla, A., de la Rosa E.J.,
Pollerberg G.E., Martínez-Salas, E., and de Pablo F.
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Fernández-Miragall, O., and Martínez-Salas, E.
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Fernández-Miragall, O., Ramos, R., López de Quinto S., and Martínez-Salas, E.
"Dual role of the FMDV IRES central domain in
organizing RNA-structure and RNA-protein interactions". J. Virol. En
revision, 2003
- Martínez-Salas, E. and Fernández-Miragall, O.
Picornavirus IRES: structure-function relationship. En: "New targets and
new therapeutic agents in human RNA viruses".
Current
Pharmaceutical Design enviado, septiembre 2003.
- Martínez-Salas,
E., Fernández-Miragall, O. Reigadas, S., Pacheco, A, Serrano, P. Internal ribomoe
entry site elements in eukaryotic genomes. Current Genomics enviado, octubre
2003.
Laboratorio de Variabilidad Genética del VIH
de la Fundació irsiCaixa.
Responsable: Miguel Angel Martínez de la Sierra
Hospital Universitari Germans Trias i Pujol
Ctra del Canyet s/n,
08916 Badalona
Teléfono: 934656374 Fax: 934653968
Miguel Angel Martínez de la Sierra, Investigador
Principal, mamartz@ns.hugtip.scs.es
Mireilla Giménez-Barcons, Postdoctoral, mireiagimenez@yahoo.com
Rosario Sabariegos, Postdoctoral, charoantonio@terra.es
Natalia Tapia, Becaria Predoctoral, natapse@hotmail.com
Guerau Fernández, Becaria Predoctoral,
guerau7@hotmail.com
Sandra Franco, Becaria Predoctoral, safraci@yahoo.com
Mariona Parera, Tecnico de laboratorio,
mparera@ns.hugtip.scs.es
Actividad Científica.
Líneas de Investigación
Al igual que otros virus RNA, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tiene una alta tasa de mutación como consecuencia de la ausencia de la actividad correctora de copia en la transcriptasa en reverso vírica. Desde hace tiempo se conoce que dentro del conjunto de virus mutantes (denominado cuasiespecie) existen variantes que permiten una mejor respuesta adaptativa del virus a un cambio ambiental. De esta manera, la selección de virus variantes representa un mecanismo importante en la evasión del sistema inmune, en el establecimiento de la persistencia vírica y en la generación de virus resistentes a drogas antivirales. Aunque los tipos y niveles de variación genética del VIH han sido bien caracterizados en las últimas dos décadas, todavía queda mucho por descubrir en este campo. Así por ejemplo, es todavía controvertida la contribución de la diversidad genética del VIH en el colapso del sistema inmune y en el desarrollo de la enfermedad.
En nuestro laboratorio estamos
estudiando la evolución genética del VIH en pacientes sometidos a terapia
antirretroviral. Mediante el estudio de la evolución del VIH durante el
transcurso de la terapia antirretroviral esperamos comprender mejor la
evolución de los virus resistentes. Además, el análisis de la evolución de los
virus resistentes es una excelente herramienta para el estudio de la dinámica
de poblaciones del VIH.
Teniendo en cuenta
la alta tasa de mutación del VIH, también estamos intentando, mediante el uso
de mutagénesis química, empujar al VIH mas allá del umbral de la catástrofe de
error. El mantenimiento de la información genética de cualquier organismo
requiere un nivel mínimo de fidelidad durante la replicación de su genoma. Por
lo tanto, un exceso de mutaciones debería eliminar la infectividad vírica. Así,
estamos caracterizando la actividad antiviral de una serie de análogos de
nucleósido mutagénicos. Esta línea de investigación la estamos llevando a cabo
ex vivo, es decir, mediante la utilización de VIHs manipulados genéticamente y
técnicas de cultivo de tejidos. Este abordaje puede representar una estrategia
nueva frente al VIH y el SIDA. Por último, hemos abierto recientemente una
nueva línea de investigación relacionada con la denominada interferencia de RNA (RNAi) o silenciamiento génico
post-transcripcional (PTGS). De esta manera,
nos proponemos utilizar RNAi específicos de diferentes genes del VIH-1,
así como de genes celulares esenciales (e.g receptores celulares) para la
replicación de ambos virus. La inhibición específica de la replicación viral
nos está permitiendo la caracterización de los mecanismos y componentes
moleculares involucrados en el silenciamiento génico y la identificación de
posibles dianas antivirales, tanto en los diferentes genes virales como en los
celulares.
Un mejor conocimiento del potencial evolutivo del VIH mejorará sin duda el desarrollo de nuevas drogas antivirales y vacunas, así como el manejo clínico de los pacientes infectados con VIH.
Proyectos en vigor:
Interferencia de RNA:
aplicación en la búsqueda de nuevas dianas antivirales. Fundación para la
investigación y prevención del SIDA en España (FIPSE). Ministerio de Sanidad y
consumo. Periodo Octubre 2002-septiembre 2004.
Mutagènesi letal, una nova estratègia antiviral. Fundació La Marató de
TV3. Periodo 2002-2004.
Virología. Xarcha temàtique. Dursi. Periodo 2003-2004.
Inhibición de la replicación del
VIH mediada por RNAs interferentes. Ministerio de Ciencia y Tecnología. Periodo
2004-2006.
Interferencia de RNA: aplicación en la búsqueda de nuevas dianas
antivirales. Fundació Barcelona SIDA 2002. Periodo noviembre 2003-noviembre
2004.
- Martínez, MA, Cabana,
M, Ibáñez, A, Clotet, B, Arnó, A and Ruiz, L. (1999). Human Immunodeficiency Virus Type 1 genetic
evolution in patients with prolonged supresión of plasma viremia. Virology 256, 180-187. A
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Menéndez-Arias, L. (1999). Mutational
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- Martínez, MA
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- Arnó, A, Ruiz, L, Juan, M, Jou, A, Balagué, M, Zayat, MK, Marfil, S,
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Romeu, J, Pujol-Borrell, R, Lane, C and Clotet, B (1999). Efficacy of low-dose subcutaneous
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Responsable: Raúl
Méndez de la Iglesia
Centre
de Regulació Genómica
Gene
Regulation Programme
Passeig
Marítim 37-49
08003-Barcelona
Teléfono:
93-2240919 Fax: 93-2240899
Componentes del Grupo
Raúl
Méndez , Jefe de Grupo, raul.mendez@crg.es
Isabel
Novoa, isabel.novoa@crg.es
María
Piqué, maria.pique@crg.es
Eulalia
Belloc, eulalia.belloc@crg.es
Carolina
Eliscovich, Carolina.eliscovich@crg.es
The primary interest of our group is to understand the molecular
mechanisms that control the temporal and spatial translation of mRNAs during
the cell cycle progression and early embryonic development. Early development
is programmed, at least in part, by maternally inherited mRNAs. These mRNAs are
not translated en masse at any one time, or even at any one place - rather,
their translation is specifically regulated by sequences located at the
3´-untranslated region (3´-UTR) of the mRNA and their binding proteins.
Cytoplasmic polyadenylation is one the most important mechanisms for regulating
translation during meiotic progression. We take a biochemical and molecular
biological approach to identify the sequences and factors that control
polyadenylation-induced translation in Xenopus
oocytes.
The knowledge of the molecular mechanisms that govern translational
control during meiotic progression will then be applied to other mRNAs during
cell cycle progression and DNA-damage induced apoptosis in somatic cells.
Líneas de
Investigación:
1.- Determination of
the 3’-UTR features that define the timing of cytoplasmic polyadenylation and
the silencing of an mRNA
The
Cyclin B family is composed of five functionally redundant members that are
differentially expressed during oogenesis and meiosis. The detailed analysis of the cis-acting
elements present in those mRNAs has allowed us to propose a global mechanism of
CPE-mediated translational regulation based in a combinatorial model of three
cis-acting elements (i.e., NRE, CPE and Hexanucleotide), which recruit three trans-acting
factors (i.e., Pumilio, CPEB and CPSF).
The number, relative position and exact sequence of these elements
determine the specific time and amount of polyadenylation, as well as the
active repression of the mRNA, allowing for a very accurate control of gene
expression.
2- Cytoplasmic polyadenylation of Xkid and TPX2 mRNAs and its role in
the mitotic spindle formation and chromosome segregation during cell
division: Once polyadenylation takes place during oocyte
maturation, most of the CPEB (~90%) is destroyed; virtually all that remains
stable is confined to animal pole blastomeres where it is strongly associated
with spindles and centrosomes. When
injected into embryos, reagents that are known to disrupt
polyadenylation-induced translation (e.g., CPEB antibody or a CPEB dominant
negative mutant) inhibit cell division and produce abnormal mitotic structures.
These results suggest that cell division requires polyadenylation-induced
translation, but they do not indicate which mRNA(s) might be involved (Groisman
et al., 2000).
Xkid chromokinesin and TPX2 are required for chromosome alignment and
the organization of spindle poles and encoded by mRNAs containing putative
CPEs.
Given the expression and localization profiles of Xkid and TPX2 as well
as the phenotypical similarities between interfering CPEB activity and the
activities of Xkid and TPX2 we hypothesize that CPEB could regulate temporarily
and spatially the expression of both factors.
Indeed, we have demonstrated that the 3’-UTRs of the mRNAs encoding for
Xkid and TPX2 are cytoplasmically polyadenylated and mediate CPEB-regulated
translation. We are currently
investigating whether the 3’-UTRs of Xkid and TPX2 mRNAs mediate spindle
localized translation.
3- Functional
screening to identify new cytoplasmically polyadenylated mRNAs that regulate
cell cycle progression: Up to the date, only a small number of mRNAs
with functional CPEs have been identified, all of then involved in the
regulation of cell cycle. However, these few examples are far from accounting
for all the targets of the CPE-mediated translational control during meiotic
progression. Therefore, we have
designed a functional screening to identify new cytoplasmically polyadenylated
mRNAs, both during the PI®MI
transition and the MI®MII
transition
Recently, “somatic”
isoforms of CPEB have been identified in mice and It has been shown that cyclin B1 mRNA is polyadenylated in M phase
and deadenylated in S phase (Groisman et
al., 2002). We are developing a screening to isolate mRNAs that are polyadenylated at
any specific phase of the cell cycle in somatic cells.
4- Translational control of
p53 mRNA in response to DNA damage: g-Irradiation of cells leads to a rapid increase in p53
protein biosynthesis even in the presence of transcriptional inhibition,
suggesting that p53 biosynthesis is regulated at the translational level. p53 mRNA must be stored in an inactive state
in actively dividing cells and translationaly activated during cell cycle
arrest or in response to genotoxic agents, when p53 is expressed. However, cells derived from patients with
acute myelogenous leukemia (AML) fail to activate p53 mRNA translation in
response to g-irradiation,
suggesting that an element(s) implicated in the translational control of the
mRNA encoding for p53 is defective.
Proyectos en vigor:
Financing agency: Ministerio de Ciencia
y Tecnología (Programa Ramón y Cajal).
Date:
2001-2006. P.I. Raúl Méndez
Financing agency:
Ministerio de Ciencia y Tecnología (Programa Ramón y Cajal).
Date: 2003-2008. P.I. Isabel Novoa.
Financing agency:
Ministerio de Ciencia y Tecnología. (SAF2002-03201).
Date:
2002-2005. P.I. Raúl Méndez.
Financing agency:
Fundación “la Caixa”.
Date:
2003-2006. P.I. Raúl Méndez.
Financing agency:
Fundación Marato TV3
Date: 2003-2006. P.I. Raúl Méndez.
Publicaciones
relevantes (1999-2003):
-
Stebbins-Boaz B, Cao Q, de Moor CH, Mendez R, Richter JD. (1999). Maskin is a CPEB-associated factor that
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Grupo
Interacciones entre el Virus de la Gripe y la Célula
Hospedadora
Responsable: Amelia Nieto,
Centro Nacional de
Biotecnología
Cantoblanco
28049 Madrid
Teléfono: 91 Fax: 91
Amelia Nieto, Científico Titular, anmartin@cnb.uam.es
Maite Huarte, Posdoctoral, mhuarte@cnb.uam.es
Idoia Burgui, Becaria
Predoctoral, iburgui@cnb.uam.es
Alicia Pérez, Becaria
Predoctoral, aperez@cnb.uam.es
Ariel Rodríguez, Becaria
Predoctoral, arguez@cnb.uam.es
Lineas de investigación:
Nuestro trabajo se centra actualmente
en el estudio de como el virus de la gripe interfiere con el metabolismo de la
célula infectada. Este estudio se realiza atendiendo a dos aspectos:
1.-
Los virus al tener una escasa capacidad codificante, necesitan de la maquinaria
célular para completar sus ciclos replicativos y esto es particularmente
importante para la etapa de traducción de proteínas, ya que todos los virus
utilizan la maquinaria de traducción de la célula a la que infectan para
traducir sus propios mensajeros. Los virus han desarrollado una variedad enorme
de estrategias para que la célula infectada traduzca preferencialmente los mRNA
virales, dependiendo de la naturaleza de su genoma o de la de sus mRNAs. En el
caso particular del virus de la gripe, sus mRNAs poseen cap en su extremo 5´ y
una cola de polyA en su extremo 3’, aunque la adicción del cap y del polyA no
la realice la maquinaria celular sino que se lleva a cabo gracias a la
actividad de la RNA polimerasa viral. En cualquier caso los mRNAs del virus de
la gripe son indistinguibles de los celulares y por tanto tienen que existir
mecanismos que permitan diferenciar del conjunto de mRNAs a los mensajeros
virales que son traducidos preferencialmente durante la infección. En nuestro
grupo hemos caracterizado que la proteína NS1 está implicada en esta activación
selectiva y hemos caracterizado su mecanismo de acción. La proteína NS1
interacciona tanto in vivo como in vitro y de una manera directa con el factor
de iniciación de la traducción eIF4GI y también con la proteína de unión a polyA,
PABP1. El factor eIF4GI es clave para la regulación de la iniciación de la
traducción. eIF4GI gracias a su unión con la proteína eIF4E que es la encargada
de reconocer al extremo 5´ cap de los mRNAs, y con el factor 3 que a su vez se
une a la subunidad ribosomal menor, determina el mRNA que va a ser traducido.
Por ello el mensajero que se une a eIF4GI es aquel sobre el que se van a
reclutar ribosomas y por tanto va a ser traducido. Además eIF4GI se une a la
proteína PABP1 que está unida al polyA, ello favorece la circularización de los
mensajeros y parece que estimula la reinicación. Además de la interacción de
NS1 con eIF4GI y con PABP1, hemos mostrado que NS1 interacciona
especificacmente con los RNAs virales, posiblemente por su extremos 5’ que es común
a todos los mRNAs. Nuestro modelo postula que NS1 al interaccionar con el
extremo 5’ de los mRNAs virales y con las proteínas de iniciación de la
traducción reclutaria ribosomas selectivamente sobre estos mRNAs activando su
traducción. En la actualidad estamos estudiando tanto la contribución de los
extremos 5’ y 3’ en esta activación selectiva gracias al uso de virus que
contienen mutaciones puntuales en estos extremos, como la posible traducción de
los mRNAs virales por un mecanismo independiente del cap.
2.-
El otro aspecto que estudiamos es la interferencia que el virus de la gripe
ocasiona sobre los procesos nucleares de expresión génica de la célula
infectada. Mediante análisis tanto in vivo como in vitro hemos caracterizado
que una de las subunidades de la RNA polimerasa viral, interacciona con un
factor celular que se denomina CLE. Esta proteína CLE pertenece a una familia
de reguladores transcripcionales que está muy conservada desde S. cerevisiae
hasta humanos. En la actualidad estamos caracterizando cual es la función de
esta proteína en la célula no infectada y cuál es su relación funcional con la
polimerasa viral. Hemos caracterizado que esta proteína interacciona con la RNA
polimerasa celular y también que se encuentra localizada en sitios activos de
transcripción, lo que estaría de acuerdo con su pertenencia a la familia de
moduladores transcripcionales que indican los datos de homología de secuencias.
Además estamos analizando el efecto que el silenciamiento de este gen tiene
tanto en la célula normal como en la célula infectada.
Responsable:
Modesto Orozco López
Institut
de Recerca Biomédica
Parc
Cientific de Barcelona
Josep
Samitier 1-5. Barcelona 08028
Teléfono:
93 403 71 56 Fax: 93 403 71 57
Modesto Orozco, Catedrático
de Universidad, modesto@mmb.pcb.ub.es
Francisco Javier
Luque, Catedrático de Universidad, javier@far1.far.ub.es
Xavier
de la Cruz, Investigador Senior ICREA. xavier@mmb.pcb.ub.es
Josep
Lluis Gelpí. Profesor Asociado. gelpi@mmb.pcb.ub.es
Actividad Científica
Líneas de Investigación:
D)
Estudio de
formas inusuales del ácidos nucleicos de potencial impacto biomédico y
biotecnológico.
Nuestro grupo ha venido trabajando los últimos 10
años en el estudio de formas inusuales de ácidos nucleicos mediante técnicas
computacionales de simulación molecular. Estructuras analizadas incluyen
triplexes, cuadrúplexes, híbridos de DNA y RNA con otros polímeros de ácidos
nucleicos. Hemos también descrito nuevas maneras de estabilizar o hacer más
específicas algunas estructuras inusuales de especial importancia biomédica.
Todo ello se ha realizado siempre en colaboración con colegas experimentales.
Por su especial importancia queremos señalar las colaboraciones con los grupos
de Carlos González y Ramón Eritja.
E)
Minería de
datos genómicos
En esta línea tratamos de desarrollar
herramientas para el procesado de datos genómicos. Son de destacar los estudios
sobre predicción de impacto estructural de splicing alternativo, los de
predicción de carácter patológico de mutaciones y los de muestreo de bases de
datos para la detección de regiones dianas para formación de triple hélice.
F)
Estudios de
reconocimiento molecular en proteínas
Hemos analizado el reconocimiento molecular
en proteínas de interés biomédico. Muchos de estos proyectos están enmarcados
en estrategias de diseño de fármacos asistidos por ordenador. Es de destacar en
este campo el desarrollo de algoritmos de docking y de caracterización de
centros activos.
G)
Desarrollo de
algoritmos para el estudio de sistemas modelo
Aquí nuestro esfuerzo se ha centrado en el
campo de la descripción de las interacciones moleculares y de la solvatación.
Proyectos en vigor:
Subvención para Grups de Recerca Consolidats. 2001SGR.
Generalitat de Catalunya. 2002-2004.
Investigador principal M.Orozco.
Ayuda fundación Ramón Areces. Estudios Bioinformaticos de
las mutaciones patológicas. Investigador principal M.Orozco.
Red Catalana de Bioinformatica. Direcció General de Recerca.
2003-2004.
BIO2003-06848. MCyT. Plan Nacional de Biotecnología
“Simulaciones Teoricas de formas inusuales del DNA. Implicaciones
biotecnológicas y biomédicas”.
2004-2006.
Investigador principal M.Orozco.
Fundación BBVA. Acción especial de Bioinformatica. “Design of new oligonucleotide-based antigene and antisensetherapies”.
Fundación Genoma España. Nodo Español de referencia en Bioinformática
Estructural. 2003-2006.
Publicaciones relevantes (1999-2004)
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methods for the simulation of nucleic acids”. Chem.Soc.Rev. (2003) 32,
350-364.
- A.Aviño, M.Frieden,
J.C.Morales, B.G. de la Torre, R.Güimil-García, M.Orozco,
C.González and R.Eritja. “Properties of triple helices formed by
oligonucleotides containing 8-aminopurines”. Nucleosides and Nucleotides.
(2003), 22, 645-648.
- A.Aviñó, E.Cubero,
C.González, R.Eritja and M.Orozco. “Antiparallel
triple helices. Structural characteristics and stabilization by 8-amino
derivatives”. J.Am.Chem.Soc. (2003), 125, 16127-16138.
- E.Cubero,
N.Abrescia, J.A.Subirana, F.J.Luque and M.Orozco.
“Theoretical study of a new structure of DNA: The antiparallel Hoogsteen
duplex”. J.Am.Chem.Soc. (2003), 125, 14603 -14612.
- J.R.Blas,
F.J.Luque and M.Orozco. “Unique tautomeric
properties of isoguanine”. J.Am.Chem.Soc (2004), 126, 154-164.
- M.Orozco, M.Rueda, J.R.Blas, E.Cubero, F.J.Luque and
C.A.Laughton. “Molecular dynamics simulation of nucleic acids”. Encyclopedia
of Computational Chemistry (2203). In Press
- R.Goñi, X de la
Cruz and M.Orozco. “Triplex target sequences in
the human genome”. Nuc. Acid. Res
(2004), 32, 354-360.
- A.Valenzuela, D.Talavera, M.Orozco and X. de la Cruz. “Alternative splicing and the modulation of
protein function among species”. J.Mol.Biol (2004), 335, 495-502.
Grupo Replicación y Expresión Génica del Virus de la Gripe
Responsable:
Juan Ortín
Centro Nacional de Biotecnología (CSIC)
Campus de Cantoblanco
Universidad Autónoma de Madrid
28049 Madrid
Teléfono: 91 585 4557 Fax: 91 585 4506
Componentes
del Grupo
Juan Ortín, Profesor
de Investigación
Sandra Ufano, Becaria
Postdoctoral
Eva Torreira, Becaria
predoctoral
Nuria Jorba, Becaria
predoctoral
Estela Area, Becaria
predoctoral
Patricia Villacé, Becaria predoctoral
Urtzi Garaigorta, Becario predoctoral
Alejandro García, Becario predoctoral
Yolanda Fernández, Ayudante técnico
Resultados previos de nuestro grupo habían demostrado la interacción
de la proteína NS1 con la proteína hStaufen. Para entender el papel que esta
interacción juega en la infección, hemos estudiado la función de esta proteína
humana en células en cultivo. Se han purificado complejos intracelulares que
contienen hStaufen mediante dos pasos de cromatografía de afinidad por el
método TAP. Estos complejos contienen un conjunto repetitivo de proteínas cuya
identificación por espectrometría de masas está en proceso (Villacé y cols,
resultados no publicados).
Los RNAs
asociados a estos complejos han sido identificados por clonaje y la
especificidad de su unión se ha verificado mediante el uso de un mutante de
hStaufen defectivo para la unión a RNA in vitro. Entre los RNAs específicos
destacan los de hGoliath y complexina-1, ya que sus genes juegan un papel
importante en el desarrollo y la diferenciación (Marión y cols., resultados no
publicados).
Análisis funcional de la polimerasa viral
Usando como base el alineamiento de secuencias de la subunidad PB2 de
la polimerasa con proteínas que se unen a estructuras cap, se han generado mutantes puntuales en esta subunidad que
alteran posiciones conservadas entre ellas. Una serie de estos mutantes dan
lugar a complejos de polimerasa que están afectadas en su función biológica
pero no en la formación del complejo. El análisis de su funcionalidad en un
sistema de reconstitución in vivo mostró que su capacidad para replicar vRNAs
modelo estaba afectada. Sin embargo, las RNPs mutantes generadas no presentaban
defectos en su capacidad para transcribir in vitro, en un sistema dependiente
de iniciadores con cap. Estos
fenotipos indican que las mutaciones introducidas en PB2 afectan la replicación
pero no la transcripción del genoma viral, en contra de las predicciones
iniciales. Estas conclusiones fueron avaladas al estudiar los fenotipos de
virus mutantes en cuyos genes de PB2 se habían introducido las mutaciones
indicadas. Estos virus mutantes mostraban retraso en su cinética de
replicación, en la síntesis de proteínas virales y en la acumulación de RNAs,
pero su transcripción primaria (independiente de replicación) no estaba
afectada.
Estudios
estructurales de la ribonucleoproteína (RNP) y la polimerasa del virus de la
gripe
Las RNPs virales generadas por reconstitución y
replicación in vivo a partir de cDNAs han sido estudiadas por microscopía
electrónica de muestras teñidas y reconstrucción tridimensional de imágenes. A
partir de una genoteca de RNPs con vRNA moldes de longitud variable se
seleccionó una variante de 248 nucleótidos para su estudio detallado. Su
reconstrucción tridimensional ha permitido revelar una estructura circular en la
que se pueden apreciar 9 monómeros de nucleoproteína (NP) y el complejo de la
polimerasa. El anillo de NP presenta fuertes interacciones entre sus monómeros
en la base de la estructura, sugiriendo que el vRNA puede estar localizado en
dicha zona. Además, los monómeros de NP presentan una vorticidad que puede ser
la causa de la estructura superhelicoidal que presentan las RNPs de mayor
longitud. La polimerasa interacciona de manera desigual con los dos monómeros
de NP adyacentes. Este modelo tridimensional es la primera información
estructural detallada de una RNP de virus con RNA de polaridad negativa.
Estudios más recientes sobre el complejo de la polimerasa de estas RNPs ha
permitido incrementar su resolución e identificar las regiones en las que se
localizan sus subunidades.
Proyectos
en vigor:
Estructura de la
ribonucleoproteína del virus de la gripe: Estudio de los mecanismos de
transcripción y replicación y de los factores celulares implicados. DGICYT. 2002-2004
La proteína NS1
del virus de la gripe: Estudio de sus funciones durante la replicación viral y
uso del gen NS1 como diana para generar virus vacunales atenuados. Comunidad de
Madrid. 2002-2004
Publicaciones
relevantes (1999-2003):
- Marión, R.M.,
Fortes, P., Beloso, A., Dotti, C. and Ortín,
J. 1999. A human sequence homologue of staufen is an RNA-binding protein
that localizes to the polysomes of the rough endoplasmic reticulum Mol. Cell.
Biol. 19, 2212-2219.
- Portela, A.,
Zürcher, T., Nieto, A. and Ortín, J.
1999. Replication of rthomyxoviruses. Advances in Virus Res., 54, 319-348.
- González, S. and
Ortín, J. 1999. Characterization
of the influenza virus PB1 protein binding to vRNA: Two separate regions of the
protein contribute to the interaction domain. J. Virol., 73, 631-637.
- Kiebler, M.A.,
Hemraj, I., Verkade, P., Köhrmann, M., Fortes, P., Marión, R.M., Ortín, J. and Dotti, C. 1999. The
mammalian Staufen protein localizes to the somatodendritic domain of cultured
hippocampal neurons: implications for its involvement in mRNA transport. J. Neurosciences, 19, 288-297.
- Mena, I.,
Jambrina, E., Albó, C., Perales, B., Ortín,
J., Arrese, M., Vallejo, D. and Portela, P. 1999. Mutational analysis
of influenza A virus nucleoprotein: identification of mutations that affect RNA
replication. J. Virol., 73, 1186-1194.
- Falcón, A.M.,
Fortes, P., Marión, R.M., Beloso, A. and Ortín,
J. 1999. Interaction of influenza virus NS1 protein and the human homologue
of Staufen in vivo and in vitro.
Nucleic Acids Res. 27, 2241-2247.
- González, S. and
Ortín, J. 1999. Distinct
regions of influenza virus PB1 polymerase subunit recognize vRNA and cRNA templates. EMBO J. 18,
3767-3775.
- Ortega, J.,
Martín-Benito, J., Zürcher, T., Valpuesta, J.M., Carrascosa, J.L. and Ortín, J. 2000. Ultrastructural
and functional analyses of influenza virus ribonucleoproteins (RNPs)
reconstituted from cloned genes suggestdimerization of nucleoprotein during
amplification of RNPs. J. Virol, 74, 156-163.
- Perales, B.,
Sanz-Ezquerro, J.J, Gastaminza, P., Ortega, J., Fernández-Santarén, J., Ortín, J. and Nieto, A. 2000. The
replication activity of influenza virus polymerase is linked to the capacity of
the PA subunit to induce proteolysis. J. Virol. 74,
1307-1312.
- Aragón, T., de
la Luna, S., Novoa, I., Carrasco, L., Ortín,
J. and Nieto, A. 2000. Translation factor eIF4GI is a cellular target
for NS1 protein, a translational activator of influenza virus. Mol. Cell. Biol.
20, 6259-6268.
- Zürcher, T.,
Marión, R.M. and Ortín, J. 2000. The protein synthesis shut-off induced by
influenza virus infection is independent
of PKR activity. J. of Virol. 74, 8781-8784.
- Martín-Benito,
J., Area, E., Ortega, J., Llorca, O., Valpuesta, J.M., Carrascosa J.L.and Ortín, J. 2001. Three dimensional
reconstruction of a recombinant influenza virus ribonucleoprotein particle. EMBO Rep. 21, 313-317.
- Huarte, M., Sanz-Ezquerro, J.J., Roncal,
F., Ortín, J. and Nieto, A. 2001. PA subunit from influenza virus
polymerase complex interacts with a cellular protein
with homology to a family of transcriptional activators. J. Virol, 75,
8597-8604.
- Gschoesser, C., Almanzar, G.,
Hainz, U., Ortin, J., Schonitzer,
D., Schild, H., Saurwein-Teissl, M., Grubeck-Loebenstein, B. 2002. CD4(+) and CD8(+) mediated cellular
immune response to recombinant influenza nucleoprotein. Vaccine,
20, 3731-3738.
- Gastaminza,
P., Perales, B., Falcón, A.M. and Ortín, J. 2003. Influenza virus mutants in the N-terminal region of
PB2 protein are affected in virus RNA replication but not transcription. J. of
Virol. 77, 5098-5108 .
- Ortin J. 2003. Unraveling the replication
machine from negative-stranded RNA viruses. Structure 11, 1194-1196.
- Huarte M., Falcon A., Nakaya Y., Ortin J., Garcia-Sastre A., Nieto A.
2003. Threonine 157 of
influenza virus PA polymerase subunit modulates RNA replication in infectious
viruses. J Virol. 77, 6007-6013.
- Area, E.,
Martín-Benito, J., Gastaminza, P., Torreira, E., Valpuesta, J.M., Carrascosa,
J.L. and Ortín, J. 2004. Three dimensional
structure of the influenza virus polymerase complex: localization of subunit
domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 308-313.
Grupo de Síntesis,
Estructura y Aplicaciones de Ácidos Nucleicos
Departament de Química Orgànica
Facultat de Química, Universitat de Barcelona
Martí i Franquès 1-11,
E-08028 Barcelona
Teléfono: 93 4034824 y 93 4021263. Fax: 93 3397878
Web: http://www.qo.ub.es/WEB01/Grups/home10n.sp.html
Enrique Pedroso, Catedrático, epedroso@ub.edu
Anna Grandas, Profesora Titular,
Jordi Robles, Profesor Titular,
Nuria Escaja, Profesora Ayudante,
Vicente Marchán, Profesora Ayudante,
Carsten Uerpmann, Postdoctoral,
Berta Algueró, Becaria Predoctoral,
José A.
Ortiga, Becaria Predoctoral,
Daniel Pulido, Becaria Predoctoral,
Líneas
de Investigación:
El grupo de investigación persigue el desarrollo de
métodos de síntesis de análogos de oligonucleótidos que tengan: - interés estructural
-
interés biológico
-
potencial terapéutico
En
esencia, se trata de explorar las bases del reconocimiento molecular entre
cadenas de ácidos nucleicos (DNA y RNA) y de éstos con péptidos, proteínas y
pequeños ligandos con la vista puesta principalmente en el diseño y la síntesis
de nuevos agentes terapéuticos.
Las líneas de investigación desarrolladas en el grupo
abarcan numerosos temas. Actualmente nuestro interés se centra en las
siguientes grandes líneas:
Oligonucleótidos cíclicos
· Desarrollo de métodos de
síntesis en fase sólida y en disolución asistida por un molde.
· Utilización como : - Modelos de estructuras curvadas y de cuádruplex de
DNA. El motivo bi-loop.
- Moldes de DNA y RNA polimerasas. Amplificación
enzimática por el mecanismo de círculo rodante.
- Oligonucleótidos antisentido con potencial terapéutico.
· Desarrollo de un esquema de síntesis de
conjugados péptido-oligonucleótido que permita incorporar cualquier aminoácido
o nucleósido.
· Diseño y síntesis de híbridos modelo para:
- Estudiar el modo de acción del
cisplatino y del transplatino.
- Reproducir la unión covalente
topoisomerasa I - DNA.
- Estudiar las interacciones DNA
bicatenario-proteína.
Oligonucleótidos formadores de triples hélices
· Preparación de análogos de
oligonucleótidos, potencialmente útiles en terapias antigen y que formen
triples hélices más estables que los naturales, mediante la introducción de:
- Análogos de bases con la estructura dadora de
puentes de H de la citosina protonada.
- Uniones internucleosídicas modificadas en forma
de fosforamidatos y de derivados de guanidina.
Ligandos del surco mayor y del surco menor del DNA
Abrazaderas de guanina en oligonucleótidos y PNAs
Incorporación de marcas de 15N o grupos
alquilo en timinas de cadenas oligonucleotídicas
Conjugados acridina-oligonucleótido como de
inhibidores de telomerasas
Conjugados oligonucleótido-[complejos
metálicos cilíndricos]
- Frieden, M.; Grandas, A.; Pedroso, E. Chem. Commun., 1999,
1593-1594. Making cyclic RNAs easily available.
- Salisbury, S. A.; Wilson, S. E.; Powell, H. R.; Kennard, O.; Lubini,
P.; Sheldrick, G. M.; Escaja, N.; Alazzouzi, E.; Grandas, A.; Pedroso, E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 5515-5518. The bi-loop, a new general four-stranded DNA motif.
- (a) González, C.; Escaja,
N.; Rico, M.; Pedroso, E. J. Am. Chem. Soc., 1998, 119, 2176-2177. NMR Structure of two cyclic oligonucleotides. A
monomer-dimer equilibrium between dumbbell and quadruplex structures. (b) Escaja, N.; Pedroso, E.; Rico, M.;
González, C. J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 12732-12742. Dimeric solution structure of two cyclic
octamers: four-stranded DNA structures stabilized by A:T:A:T and G:C:G:C
tetrads. (c) Escaja, N.; Gelpí,
J. L.; Orozco, M.; Rico, M.; Pedroso, E.; González, C. J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 5654-5662. A four-stranded DNA structure stabilized by a novel
G:C:A:T tetrad.
- Jaumot,
J.; Escaja, N.; Gargallo, R.; González, C.; Pedroso, E.; Tauler, R. Nucleic Acids Res., 2002, 30, e92. Multivariate curve resolution: a powerfool tool for the analysis of
conformational transitions in nucleic acids.
- Frieden, M.; Pedroso, E.; Kool, E. T. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1999,
38, 3654-3657. Tightening the belt on
polymerases: Evaluating the physical constraints on enzyme substrate size.
- Robles, J.; Pedroso, E.; Grandas, A. Nucleic Acids Research, 1995,
23, 4151-4161. Solid-phase synthesis
of a nucleopeptide from the linking site of adenovirus-2 nucleoprotein, -Ser(p5’CATCAT)-Gly-Asp-.
Convergent versus stepwise strategy.
- Grandas, A.; Marchán, V.; Debéthune, L.; Pedroso, E. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,
Chapter 4: Synthesis of Modified Oligonucleotides and Conjugates, unit 4.22.
S.L.Beaucage, D.E.Bergstrom, G.Glick, R.A.Jones, Editors, John Wiley &
Sons, Inc., en prensa. Stepwise solid-phase synthesis of nucleopeptides.
- Debéthune, L.; Kohlhagen, G.; Grandas, A.; Pommier, Y. Nucleic Acids Res., 2002, 30, 1198-1204.
Processing of nucleopeptides mimicking the topoisomerase I-DNA covalent complex
by tyrosyl-DNA phosphodiesterase.
- Marchán, V.; Moreno, V.;
Pedroso, E.; Grandas, A. Chem. Eur. J.,
2001, 7, 808-815. Towards a better understanding of cisplatin mode
of action.
- Gómez-Pinto, I.; Marchán,
V.; Gago, F.; Grandas, A.; González, C. ChemBioChem,
2003, 4, 40-49. Solution structure and stability of
tryptophan-containing nucleopeptide duplexes.
- Gómez-Pinto, I.;
Marchán, V.; Gago, F.; Grandas, A.; González, C. Chem. Commun., 2003, 2558-2559. Solution structure and
stability of a disulfide cross-linked nucleopeptide duplex.
- Robles, J.; Ibáñez, V.;
Grandas, A.; Pedroso, E. Tetrahedron
Lett., 1999, 40, 7131-7134. Synthesis and triple
helix-forming ability of oligonucleotides with N,N-dimethylaminoethyl
phosphoramidate linkages.
- Robles, J.; Grandas,
A.; Pedroso, E. Tetrahedron, 2001, 57, 179-194. Synthesis of modified oligonucleotides
containing 4-guanidino-2-pyrimidinone nucleobases.
- Gorchs, O.; Hernández, M.; Garriga, L.; Pedroso, E.; Grandas, A.;
Farràs, J. Org. Lett., 2002, 4, 1827-1830. A new method for the preparation of modified
oligonucleotides.
Grupo Biotecnología de
Intrones del Grupo II
Estación
Experimental del Zaidin, CSIC
Profesor Albareda,
1
18008 Granada
Teléfono: 958
181600 Ext 308 Fax: 958 129600
Nicolás Toro Garcia, Investigador Científico,
Francisco Martínez Abarca, Científico Titular,
Manuel Fernandez López, Investigador Contratado,
José Ignacio Jiménez-Zurdo, Investigador Contratado,
Estefanía Muñoz Adelantado, Postdoctoral,
Antonio Barrientos Durán, Becario Predoctoral,
Maria Dolores Molina Sánchez, Becaria Predoctoral,
Rafael Nisa Martínez, Becario Predoctoral,
Líneas de investigación:
En los aspectos concretos relacionados con
esta propuesta, el grupo de investigación estudia los intrones del grupo II
bacterianos, en concreto el intron RmInt1 de Sinorhizobium meliloti. Los intrones del grupo II son ARNs
catalíticos y elementos genéticos móviles capaces de insertarse directamente en
sitios específicos dentro de ADN de cadena doble. Los intrones del grupo II
fueron inicialmente encontrados en organelas de plantas y eucariotas inferiores
y recientemente en bacterias y se les
considera los precursores de los intrones del núcleo de células eucariotas, de
los non-LTR-retrotransposones y de la telomerasa. La movilidad de los intrones
del grupo II, proceso conocido como “retrohoming”, está mediada por una
proteína multifuncional (IEP) codificada por el intrón en su dominio IV. Esta
proteína tiene actividad maturasa (dominio X) implicada en la maduración del
ARN precursor y la excisión del ARN del intrón en forma de lazo (“splicing”),
actividad reverso transcriptasa (dominio RT) implicada en síntesis de una ADNc
utilizando como molde el ARN del intrón insertado en su ADN diana, actividad de
desenrollamiento de ADN de cadena doble y de ADN endonucleasa (dominio endonucleasa)
implicada en el reconocimiento del ADN diana y en el corte en la posición +9 o
+10, dependiendo del intrón, de la cadena antisentido. Mientras que el proceso
de “retrohoming” para los intrones de levadura y el intrón de L. lactis es muy semejante y sigue el
proceso descrito anteriormente, el intrón RmInt1 sigue un proceso
mecanísticamente diferente al invadir el ADN diana a través de ADN de cadena
sencilla generado por la horquilla replicativa. La intrínseca especificidad de
los intrones del grupo II por el reconocimiento de la secuencia diana; el hecho
de que además ésta es relativamente grande entre 34 y 24 nucleótidos,
disminuyendo la posibilidad de encontrar secuencias repetidas incluso en
genomas complejos; el no necesitar del sistema de recombinación homóloga para
insertarse en el genoma; el hecho de que puedan insertarse dentro de ellos
secuencias de ADN, incluso genes; junto con la posibilidad de rediseñar sus
secuencias de reconocimiento de modo que se puedan insertar virtualmente en
cualquier secuencia de ADN elegida, hace que estos elementos genéticos tengan
una enorme potencialidad en ingeniería genética, en el análisis funcional de
genomas y terapia génica.
Nuestro objetivo es
desarrollar nuevas herramientas genéticas basadas en intrones del grupo II,
para la identificación de genes y en general para el análisis funcional de
genomas de interés tanto en microorganismos como en plantas.
Proyectos en vigor:
Desarrollo de nuevas herramientas genéticas basadas en intrones del
grupo II para la identificación y el análisis funcional de genes en genomas de
procariotas y plantas. MCyT Plan Nacional de Biotecnologia BIO2002-02579. Entidades participantes: EEZ-CSIC. 2002-2005.
Investigador principal: Nicolás Toro García
Ingeniería de la expresión coordinada de múltiples genes y uso para la producción y purificación de moléculas de valor industrial. MCyT Plan Nacional de Biotecnologia (PROFIT) FIT-010000-2003-110. Entidades participantes: BIOMEDAL SL, EEZ-CSIC Y OTROS. 2003-2004. Investigador principal: Nicolás Toro García
Publicaciones relevantes (1999-2003):
- F. Martínez-Abarca, F. M. García-Rodríguez, E. Muñoz y N. Toro.
1999. Biochemical demonstration of reverse transcriptase activity and splicing
efficiency of bacterial group II intron from Sinorhizobium meliloti. Nucleic Acids Symposium Series
41:117-119.
- F. Martínez-Abarca, F.M. García-Rodríguez y N. Toro. 2000. Homing of a
bacterial group II intron with an intron-encoded-protein lacking the conserved
part of the Zn domain. Molecular Microbiology 35:1405-1412.
- F. Martinez-Abarca y N. Toro. 2000. RecA-independent ectopic transposition in vivo of a
bacterial group II intron. Nucleic
Acids Research 28:4397-4402.
- F. Martinez-Abarca y N. Toro. 2000. Group II intron in
the bacterial world. MicroReview Molecular Microbiology 38: 917-926.
- E. Muñoz, P.J. Villadas y N. Toro. 2001. Ectopic
transposition of a group II intron in natural bacterial populations. Molecular Microbiology 41: 645-652.
- N. Toro, Mª Dolores Molina-Sánchez, M.Fernández-López. 2002. Identification
and characterization of bacterial class E group II introns. Gene 299:245-250.
- E. Muñoz-Adelantado, Joe San Filippo, F. Martínez-Abarca, F. M.
García-Rodríguez, A M. Lambowitz y N. Toro. 2003. Mobility
of the Sinorhizobium meliloti Group II Intron RmInt1 occurs by reverse
splicing but requires and unknown reverse transcriptase priming mechanism.
Journal of Molecular Biology 327:931-943.
- J. I. Jiménez-Zurdo, F. M. García-Rodríguez, A. Barrientos-Durán y N.
Toro. 2003. DNA Target-Site Requirements for Homing in vivo
of a Bacterial Group II Intron Encoding a Protein Lacking the DNA Endonuclease
Domain. Journal of Molecular Biology 326:413-423.
- N. Toro, F. Martinez-Abarca, M. Fernández-López y E.
Muñoz-Adelantado. 2003. Diversity of Group II
Introns in the Genome of Sinorhizobium meliloti Strain 1021: Splicing
and Mobility of RmInt1. Molecular Genetics and Genomics (MGG) 268:628-636.
- N.
Toro. 2003. Bacteria and Archaea Group II Introns; new mobile genetic
elements in the environment. Environmental Microbiology- A Review,
5:143-151.
Centre de Regulació Genómica
Gene Regulation
Programme
Passeig Marítim
37-49
08003-Barcelona
Teléfono: 93-2240920 Fax: 93-2240899
Juan
Valcárcel, Jefe de Grupo,
Brendan Bell, Postdoctoral,
Claudia
Ben-Dov, Postdoctoral,
Daniel
Bilbao, Postdoctoral,
Veronica
Raker, Postdoctoral,
Mafalda
Araujo, Becaria Predoctoral,
Nuria
Majos, Becaria Predoctoral,
Luis
Soares, Becaria Predoctoral,
Ana
Igea, Becaria Predoctoral,
Conchi
Martínez, Técnico de laboratorio,
Líneas de Investigación:
We are interested in the molecular mechanisms that control alternative
splicing during cell differentiation, development and disease. We study various
pre-mRNAs and regulatory factors, including regulators of sex determination in Drosophila and of programmed cell death
and tumor progression in mammalian cells. Several new lines of research were
started after the lab moved to CRG, including the function of the Ewing's
sarcoma protein (EWS) in RNA processing, the regulation of alternative splicing
of the transcription factor TAF6 during apoptosis and the interplay between
signal transduction pathways (e.g. Fas, TGFb signaling) and the activity of splicing regulators.
1.- Regulation of splicing and programmed cell death.
We previously
reported that TIA-1, a protein that promotes apoptosis, can regulate splicing
by promoting the assembly of U1 snRNP to weak 5' splice sites (ss) followed by
uridine-rich sequences. We have investigated the mechanism by which TIA-1
regulates alternative splicing of the Fas receptor to generate isoforms that
either promote or inhibit programmed cell death. We have found that TIA-1 and the
Polypyrimidine Tract Binding protein (PTB) compete with each other for binding
to a uridine-rich sequence in Fas exon 6. PTB inhibits association of the U2
Auxiliary Factor (U2AF) with the weak 3' splice site of intron 5 by interfering
with stabilizing molecular interactions across exon 6. In contrast, binding of
TIA-1 helps to relieve PTB inhibition and thereby promote exon 6 definition,
thus revealing a function of TIA-1 distinct from its activity on 5' splice site
recognition. Our results indicate that the balance between the activities of
TIA-1 and PTB can be an important determinant of the control of programmed cell
death.
Changes in the
extent of exon 6 skipping occur during T lymphocyte maturation, and failure to
undergo such changes results in autoimmune lymphoproliferative syndromes
(ALPS). In collaboration with the lab of Joachim Roesler (Technical University
Dresden), we have identified and characterized a mutation in an ALPS patient
where duplication of the 3’ ss AG preceding exon 6 causes complete skipping of
the exon. The effect of this mutation is distinct from that of the same
mutation in other pre-mRNAs, and appears to be linked to binding of a protein
complex that competes with recognition of the 3' ss AG by U2AF35.
2.- Function of the splicing factor U2AF and associated proteins.
The
splicing factor U2AF is important to initiate the assembly of splicing
complexes on pre-mRNAs. The 65 Kda subunit of U2AF65 recognizes the
pyridimine-rich stretch that precedes the 3’ end of higher eukaryotic introns.
The 35 Kda subunit recognizes the last two intronic nucleotides (AG). Our
recent results indicate that the protein DEK, previously implicated in
transcription and some forms of leukemia, can modulate the recognition of the
3' ss by U2AF.
Another
U2AF65-associated factor, LUCA-15, was reported to have functions in tumor
suppression and programmed cell death. We have identified genes involved in the
control of these processes whose alternative splicing is regulated by LUCA-15,
and have also observed differential modulation U2AF binding by LUCA-15 on
different types of 3' ss.
3.- Analysis of alternative splicing using DNA
microarrays
In collaboration with Angela Relogio and Vladimir Benes at the EMBL
Genomic Core Facility, oligonucleotide-based DNA microarrays were developed for
gene expression profiling of alternatively spliced transcripts. These have been
applied to a cell culture model of Hodgkin lymphoma. When different cell lines
corresponding to different stages of progression of Hodgkin’s lymphoma were
studied, changes in the expression of splicing regulators and specific spliced
isoforms correlated with tumor grade. These observations suggest that relevant
events in tumor biology are based on regulation of expression of alternatively
spliced isoforms. Changes in expression of some splicing regulators, including
ectopic expression of neuron-specific RNA binding proteins of the NOVA family,
as well as the increase in expression of the cdk2 substrate and U2 snRNP
component SAP155, have been independently verified at the RNA and protein
level. Our aim now is to use these data to obtain insights into the mechanisms
underlying changes in alternative splicing involved in tumor progression.
Proyectos en vigor:
Bundesministerium
für Bildung und Forschung. Grant coordinated by Prof. Reinhard Lührmann. Period: 2002-2005.
EU Vth
Framework Programme network. Grant coordinated by Dr. Stefan Stamm.
Period:
2002-2005.
-
Merendino, L., Guth, S., Bilbao, D., Martínez, C. and Valcárcel, J: Inhibition of msl-2 splicing by Sex-lethal reveals interaction between U2AF35
and the 3' splice site AG
Nature
402: 838-841 (1999).
Reviewed in Moore, M.J., Nature Structural Biology,
7:14-16 (2000).
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C. and Valcárcel, J: Alternative
pre-mRNA splicing: the logic of combinatorial control.
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S. and Valcárcel, J: Kinetic role of mammalian SF1/BBP in spliceosome assembly
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- Förch,
P., Puig, O., Kedersha, N., Martínez, C., Séraphin, B., Anderson, P. and
Valcárcel, J: The apoptosis-promoting factor TIA-1 is a regulator of
alternative pre-mRNA splicing.
Molecular
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-
Penalva, L.O.F., Lallena, M.J. and Valcárcel, J: Switch in 3' splice site recognition during exon definition and
catalysis is important for Sex-lethal
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Molecular
and Cellular Biology, 21: 1986-1996 (2001).
-Förch,
P., Merendino, L., Martínez, C. and Valcárcel, J: Modulation of msl-2 5' splice site recognition by
Sex-lethal.
RNA,
7: 1185-1191 (2001).
- Guth,
S., Tange, T.O., Kellenberger, E. and Valcárcel, J: Dual function for U2AF35 in
AG-dependent pre-mRNA splicing.
Molecular
and Cellular Biology, 21: 7673-7681 (2001).
- Tange,
T.Ø., Damgaard, C.K., Guth, S., Valcárcel, J. and Kjems, J: The hnRNP A1
protein regulates HIV-1 tat/rev intron splicing via a novel intronic silencer
element.
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D., Popisil, H., Valcárcel, J., Reich, J. and Bork, P: Alternative splicing and
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oligonucleotide DNA microarrays.
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http://nar.oupjournals.org/cgi/content/full/30/11/e51?ijkey=enje00PWN9gzQ&keytype=ref&siteid=nar
-
Lallena, M.J., Chalmers, K., Llamazares, S., Lamond, A.I. and Valcárcel, J:
Splicing regulation at the second catalytic step by Sex-lethal involves 3’
splice site recognition by SPF45.
Cell,
109: 285-296 (2002).
Reviewed in Graveley, B.R. Cell,
109: 409-412 (2002).
-
Woodley, L. and Valcárcel, J: Regulation of alternative pre-mRNA splicing.
Briefings
on Functional Genomics and Proteomics,, 1: 266-277 (2002).
- Förch,
P., Puig, O., Martínez, C., Séraphin, B. and Valcárcel, J: The splicing
regulator TIA-1 interacts with U1-C to promote U1 snRNP recruitment to 5’
splice sites.
EMBO
Journal, 21: 6882-6892 (2002).
- Förch,
P., Merendino, L., Martínez, C. and Valcárcel, J: The U2 Auxiliary Factor U2AF65
can promote U1 snRNP recruitment to 5’ splice sites.
Biochemical
Journal, 372: 235-240 (2003).
- Ortega,
A., Niksic, M., Bachi, A., Wilm, M., Sánchez, L., Hastie, N., and Valcárcel, J:
Biochemical function of Female-Lethal(2)D / Wilms’ Tumor Suppressor-1
Associated proteins in alternative pre-mRNA splicing.
Journal
of Biological Chemistry, 278: 3040-3047 (2003).
- Förch,
P. and Valcárcel J: Splicing regulation in Drosophila sex determination.
Prog
Mol Subcell Biol. 31:127-151 (2003).
- Bilbao,
D. and Valcárcel, J: Getting to the
heart of a splicing enhancer.
Nature
Structural Biology.10:6-7 (2003).
Grupo Control del
procesamiento del pre-mRNA en la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Responsable: Josep Vilardell
Centre de
Regulació Genómica
Pg. Marítim 37-49
08003 Barcelona.
Teléfono: 93
2240916/22 Fax: 93 2240899
http://www.crg.es/proyectos.asp?WebIdioma=Angles&ingid=23
Josep Vilardell, Jefe
de Grupo, josep.vilardell@crg.es
Mireia Bragulat, Becaria
Predoctoral, mireia.bragulat@crg.es
Sara Macías, Becaria
Predoctoral, sara.macias@crg.es
Judit Peix, Técnica
de laboratorio, judit.peix@crg.es
Líneas de Investigación:
Las interacciones RNA-proteína son un elemento crucial de sistemas moleculares como el ribosoma o el spliceosoma, y se sitúan en el centro de la regulación de la expresión génica. Un determinante fundamental de estas interacciones es el dinamismo estructural del RNA. Sin embargo, y a pesar de su relevancia, se sabe muy poco del papel que la estructura del RNA juega en el control del splicing de pre-mRNAs. Este potencial regulador sido demostrado en el gen RPL30 de Saccharomyces cerevisiae. El producto de este gen esencial, la proteína ribosomal L30, auto-regula el procesamiento del transcrito de su propio gen uniéndose a una estructura que contiene el sitio de splicing 5' (5'SS). El sistema L30/RPL30 de regulación del splicing tiene además un especial interés porque L30 inhibe el splicing durante los primeros pasos del ensamblaje del spliceosoma, de manera que permite explorar las interacciones dinámicas que ocurren durante el splicing y cómo éstas pueden ser reguladas, procesos ambos muy poco entendidos. El principal interés de nuestro laboartorio, el análisis del efecto del entorno molecular del 5'SS en su reconocimento y en el procesamiento del RNA que lo contiene, empleando S. cerevisiae como sistema modelo, se fundamenta en este sistema (Vilardell y Warner, Genes & Dev. 1994 8:211, Vilardell et al., Mol. Cell 2000 5:761). Se siguen dos aproximaciones principales, de tipo genético y bioquímico respectivamente, de las que ya se dispone de datos preliminares que las validan. Se ha iniciado el diseZo de screenings genéticos para identificar genes cuyos productos estén involucrados en la regulación del splicing de transcritos especiales, y se van a diseccionar las interacciones moleculares que intervienen en esta regulación mediante el uso de sistemas in vitro y reactivos específicos, incluyendo el empleo de nucleótidos fotosensibles en posiciones determinadas del sustrato. Las modificaciones del sustrato se basarán además en el empleo de diferentes estructuras presentes a lo largo de la cadena y que pueden ser reconocidas por distintos factores (por ejemplo MS2, del fago homónimo).
Grupo Metabolismo de RNA en Cianobacterias y
Cloroplastos
Responsable: Agustín Vioque Peña
Instituto de
Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis
Centro de
Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja
Universidad de
Sevilla-CSIC
Américo Vespucio
s/n
41092 Sevilla
Teléfono: 954489519 Fax: 954460065
Componentes del
Grupo
Agustín Vioque
Peña, Profesor Titular, vioque@us.es
María Ceballos Chávez, Becaria Predoctoral,
Mariana Álvarez de Toledo Ramírez, Técnico
Especialista de Laboratorio,
Líneas de Investigación:
La biosíntesis de los tRNAs requiere el
procesamiento de sus precursores por acción de ribonucleasas específicas que
generan los extremos 5’ y 3’ maduros de los tRNA. La ribonucleasa P (RNasa P)
es la endonucleasa responsable de la generación del extremo 5' de los tRNAs
maduros así como del procesamiento de algunos otros precursores de RNA. La
enzima es una ribonucloproteína. En bacterias, la subunidad de RNA es el
componente catalítico. Nuestros objetivos son el conocimiento detallado del
mecanismo catalítico de la ribozima RNasa P en cianobacterias, la
identificación de sus sustratos, la caracterización del enzima de cloroplasto y
su relación evolutiva con la RNasa P de cianobacterias, y el diseño de
estrategias que permitan su utilización en biotecnología vegetal. En los
últimos años hemos estudiado las propiedades estructurales y funcionales de la
RNasa P de un gran número de cianobacterias, ayudando a comprender la dinámica
evolutiva de este RNA catalítico. Hemos identificado nuevos sustratos para la
enzima y estudiado las propiedades de la interacción enzima-sustrato. Estamos
realizando una caracterización estructural y funcional de la RNasa P de
cloroplastos de algunas algas, como Cyanidium
caldarium, Cyanophora paradoxa, Nephroselmis olivacea y Porphyra purpurea.
El procesamiento en 3’ de
los precursores de tRNA en cianobacterias requiere la endonucleasa RNasa Z y la
adición del extremo CCA por la tRNA nucleotidil transferasa. Hemos purificado y
estamos caracterizando estas enzimas. Además, estamos estudiando la función de
otras enzimas en el metabolismo del RNA de las cianobacterias, como
polinucleótido fosforilasa, RNasa D, RNasa II y RNasa BN.
Proyectos en vigor:
Acciones coordinadas (Junta de Andalucía)
Responsable: Agustín Vioque Peña
Biosíntesis del RNA transferente en
cloroplastos y cianobacterias” (MCYT, BMC2001-3789). 12-2001 a 12-2004.
Responsable: Agustín Vioque Peña
Publicaciones
(1999-2003)
- Sandmann, G. and Vioque, A. (1999) Phylogeny of
carotenogenic genes and enzymes in cyanobacteria, in “The Phototrophic Prokaryotes” (G.A. Peschek, W. Löffelhardt, G.
Schmetterer, eds) Plenum Publishing Co., New York , pp 799-803.
- Pascual, A. and
Vioque, A. (1999a). Functional reconstitution of RNase P activity from a
plastid RNA subunit and a cyanobacterial protein subunit. FEBS Lett. 442, 7-10.
- Pascual, A. and
Vioque, A. (1999b) Substrate binding and catalysis by ribonuclease P from
cyanobacteria and Escherichia coli
are affected differently by the 3’-terminal CCA in tRNA precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 6672-6677.
- Tous, C. and
Vioque, A. (1999) Functional analysis of the loop J15/16 in the RNase P RNA
from the cyanobacterium Pseudanabaena
sp. PCC6903. Nucleic Acids Symp. Ser.,41, 158-160.
- Altman, S.,
Gopalan, V. and Vioque, A. (2000) Varieties of RNase P: A nomenclature problem?
RNA 6, 1689-1694.
- Vioque, A. and
Altman, S. (2001). Ribonuclease P. In “RNA”
(D. Söll, P. Moore, S. Nishimura, eds.) pp-137-154. Pergamon (ISBN 0-080-43408-8).
- Tous, C., Vega-Palas, M. A. and Vioque, A. (2001). Conditional
expression of RNase P in the cyanobacterium Synechocystis
sp. PCC6803 allows detection of precursor RNAs. Insight in the in vivo maturation pathway of transfer
and other stable RNAs. J. Biol. Chem.,
276, 29059-29066.
- Breitenbach, J., Vioque, A. and Sandmann, G. (2001).
Gene sll0033 from Synechocystis 6803 encodes a carotene
isomerase involved in the biosynthesis of all-E lycopene. Z. Naturforsch.,
56c, 915-917.
- De la Cruz, J. and
Vioque, A. (2001). Increased sensitivity to protein synthesis inhibitors in
cells lacking tmRNA. RNA 7, 1715-1720.
- Gopalan, V., Vioque, A. y Altman, S. (2002). RNase P: Varieties
and uses. J. Biol. Chem. 277, 6759-6762.
- Vioque, A. and De la Cruz, J. (2003). Trans-translation and protein synthesis inhibitors.
FEMS Microbiol. Lett., 218, 9-14.
- Eder, P. S.,
Hatfield, C., Vioque, A. and
Gopalan, V. (2003). Bacterial RNase P as a potential target for novel
anti-infectives. Curr. Op. Invest. Drugs, 4,
937-943.
- De la Cruz, J. and Vioque, A. (2003). A structural and
functional study of plastid RNAs homologous to catalytic bacterial RNase P RNA.
Gene, 321, 47-56.
- Gopalan, V.,
Vioque, A. y Altman, S. (2003). RNase P: Variations and uses. En "Life Science for the 21st Century"
(E. Keinan, I. Schechter, M. Sela, eds.) Wiley, pp. 49-59. (ISBN 3527305882).